人牙周膜干細胞的分離培養及生物學特性研究

[摘要]目的：分離篩選人牙周膜干細胞，研究其生物學特性并進行初步鑒定。方法：采用STRO-1為標記物以免疫磁珠分離篩選人牙周膜干細胞，觀察細胞生長及克隆形成情況，流式細胞儀細胞周期、細胞表型分析，免疫細胞化學染色技術檢測STRO-1、Vimentin表達，并測定細胞體外多向分化能力。結果：免疫磁珠法可獲得人牙周膜干細胞，細胞具有克隆形成能力，增殖速度低。細胞周期分析大多數細胞處于G0/G1期，為慢周期性;細胞表型分析證實CD146、CD44高表達，CD34、CD45低表達。STRO-1及Vimentin均為陽性染色，礦化誘導和成脂誘導證實該細胞具有多向分化能力。結論：免疫磁珠法是有效的分離純化牙周膜干細胞的方法。所分離細胞具有干細胞的細胞周期、表型特點及多向分化能力。

[關鍵詞]干細胞；人牙周膜干細胞；免疫磁珠；流式細胞計量術；免疫細胞化學

[中圖分類號]R783.5 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2008）05-04

Isolation， identification and bionomics of human periodontal ligament stem cells

PAN Feng1，DING Yin1，WANG Guang1，ZHAO Yu2，NI Hua2

(1.Department of Orthodontics，Stomatology Hospital，The Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China; 2.Center of Tissue Engineering， Stomatology Hospital，The Fourth Military Medical University)

Abstract:ObjectiveTo isolate and identify the periodontal ligament stem cells and demonstrate its bionomics. MethodsPDLSCs were isolated by immunomagnetic method. The flow cytometry and immunocytochemistry procedure were used to disclose the cell cycle and surface marker of the PDLSCs.Osteoinduction and adipoinduction were done to conform the multidirectional differentiation of PDLSCs. ResultsThe acquired cells had clonality and low proliferation. Most of the cells were in phase G0 /G1 and there were high expression of CD146 and CD44 on these cells， meanwhile， CD34 and CD45 were of low expression. The cells were Vimentin and STRO-1 positive while their multidirectional differentiation ability was confirmed in vitro. Conclusionimmunomagnetic method was an effective way to isolate and purify the PDLSCs. The acquired cells showed the characteristics of stem cells.

Key words:stem cell;human periodontal ligament stem cell;immunomagnetic beads;flow cytometry;immunocytochemistry

研究證實牙周膜內存在具有橫向分化能力的干細胞(牙周膜干細胞)，在體外微環境作用下還可分化為成牙骨質細胞或成骨細胞[1-2]。因此，牙周膜干細胞（PDLSCs）作為一種新發現的干細胞，在牙周組織工程研究中有較大的應用前景。但是牙周膜組織量小、分離困難，一直成為制約牙周膜干細胞研究的重要原因。已有的克隆篩選法操作程序繁瑣，周期較長[1]，因此需要尋找簡便、快捷的篩選方法來分離牙周膜干細胞。本研究應用免疫磁珠技術對人牙周膜干細胞進行篩選，并擴增培養，通過對牙周膜干細胞生長曲線、克隆形成率、細胞周期、細胞表面抗原標記物測定及多向分化能力的研究對其生物學特性進行研究，以期建立一種便捷有效的分離方法并明確牙周膜干細胞的生物學特性，為進一步研究牙周損傷的發病機理及臨床治療提供基礎。

1材料和方法

1.1實驗材料和設備：α-MEM培養基（Gibco，美國），羊抗小鼠磁珠試劑盒（Dynalbiotech，美國)，基質蛋白-l單克隆抗體(STRO-1，RD，美國)， ABC型免疫組化檢測試劑盒(Dkao，美國)；小鼠抗人波形絲蛋白單抗(Vimentin，Dkao，美國)；CD44-FITC、CD146-FITC、 CD34-FITC、CD45-FITC小鼠抗人單克隆抗體（Beckmen Coulter，美國）；CO2孵箱(Heraeus，德國)；YJ-875型超靜工作臺(蘇州凈化設備廠，中國)；流式細胞分析儀(Beckmen Coulter，美國)；倒置相差顯微鏡及照相系統(Olympus，日本)。

1.2實驗方法

1.2.1 取材及細胞培養：收集臨床拔除的正常人牙周健康、無齲的新鮮第3磨牙，刮取根中1/3牙周膜組織，移入10cm無菌培養皿內，滴加少許α-MEM培養液保持組織濕潤，銳性分離牙周膜組織約1mm3組織塊，將分離的組織塊以1mm間距平鋪于6孔板內，以無菌蓋玻片覆蓋組織塊，加入培養液(含100ml/L 胎牛血清，100μmol/L2抗壞血酸，2mmol/L2谷胺酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的α-MEM 培養液)，置入37℃、50ml/L CO2的孵箱中培養，待多數組織塊周圍有細胞游出后去除蓋玻片，常規培養，每3天換液1次，細胞生長達80%匯合時傳代。

1.2.2磁珠分離篩選牙周膜干細胞：將5μl磁珠劇烈振蕩后移入離心管內，加入5ml含1％胎牛血清的PBS沖洗，放置于磁力架上靜置2min后去上清，重復一次后重懸，置4℃備用。收集第4代人牙周膜細胞1×108個，以含1％胎牛血清的PBS重懸，加入小鼠抗人STRO-1抗體，4℃孵育60min，每隔10min輕振以防沉淀。以含1％胎牛血清的PBS清洗3次，去除殘留抗體后重懸并加入磁珠，4℃孵育30min，每5min輕振一次。離心，去除含空白磁珠的上清液，以含1％胎牛血清的PBS重懸，將離心管置于磁力架上2min，緩慢棄除上清及未與磁珠結合的細胞。以含1％胎牛血清的PBS再次重懸并清洗與磁珠結合的細胞2次，棄上清，加入磁珠分離液，輕晃均勻2min后置于磁力架上2min，取上清液，重復2次以去除殘存磁珠，離心，加入5ml含10％胎牛血清的α-MEM培養液，重懸，調整細胞濃度為1×104/ml接種于6孔板內，37℃、50ml/L CO2的孵箱中培養。

1.3 牙周膜干細胞生物學特性的研究

1.3.1細胞生長曲線測定：分別取篩選培養的牙周膜干細胞及牙周膜細胞，以1×103cells/孔接種于96孔塑料板，每組3孔，隔日換液。每天取一組，MTT法測各孔OD值，連續測10天，以時間為橫軸、細胞數為縱軸繪制生長曲線。

1.3.2 克隆形成率測定：將收集的對數生長期牙周膜細胞的培養上清1 500rpm離心10min，經0.22μm直徑的小濾器過濾后，與培養基以l:l比例混合作為適應性培養基。取篩選培養的牙周膜干細胞，調整細胞密度至10～15個/ml，100μ1/孔接種于96孔培養板中，培養12h后標記單個細胞孔，并補液至200μ1/孔，5天換液，光鏡下觀察克隆形成情況。

1.3.3 流式細胞儀分析

1.3.3.1細胞周期分析：取篩選培養的牙周膜干細胞，胰酶消化，調整細胞密度為1×107/ml， PBS清洗2次，加入0.01mol/LPBS重懸，再加入預冷的無水乙醇2ml吹打混勻，4℃過夜，離心棄乙醇，0.01mol/LPBS清洗2次，加入5ml/L碘化丙錠1ml，4℃30min，過300目的尼龍篩網，流式細胞儀上機，進行細胞周期檢測。

1.3.3.2表面抗原測定：取篩選培養的牙周膜干細胞， 棄去培養液，PBS清洗兩次，以含0.25% 胰蛋白酶的PBS液消化5 min，制成單細胞懸液，再以含2%牛血清白蛋白和0.1%偶氮鈉的磷酸鹽緩沖液(流式緩沖液)沖洗細胞， 調整細胞密度為3.0×109/L，每個Eppendof管加100μL細胞懸液，室溫下分別與CD44-FITC、CD146-FITC、 CD34-FITC、CD45-FITC小鼠抗人單克隆抗體5μL避光孵育15min，再以流式緩沖液清洗細胞，1 000rpm離心5min，將細胞重懸于含1%多聚甲醛的流式緩沖液0.5ml固定。使用同型對照單克隆抗體確定背景標記。用流式細胞儀分析熒光細胞，專用配套軟件計算細胞表面抗原陽性率，單位用%表示。

1.3.3.3 免疫細胞化學染色：取篩選培養的PDLSCs制備細胞爬片， 免疫細胞化學ABC法進行STRO-1及Vimentin染色，陰性對照以PBS替代一抗，進行細胞來源及表達檢測，光鏡下觀察。

1.3.3.4體外多向誘導分化：①礦化誘導：取篩選培養的牙周膜干細胞制成細胞懸液，調整細胞密度為2×104/ml接種于6孔板中，以含10%胎牛血清的α-MEM培養24h后換礦化誘導液(100μg/ml鏈霉素、100U/ml青霉素、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μg/ml維生素C、1×10-8mol/L地塞米松、10ml/L胎牛血清、α-MEM培養液)培養，隔日換液。培養3周后吸棄培養液， PBS清洗， 95%酒精固定10min ，PBS清洗2次，加入0.1%茜素紅(Alizarin Red-S)室溫染色30min，去離子水清洗3次，光鏡下觀察。②成脂誘導：取篩選培養的牙周膜干細胞制成細胞懸液，調整細胞密度為1×105/ml接種于6孔板中，以含10%胎牛血清的α-MEM培養24h后換成脂誘導液（地塞米松10-6mol/L、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤0.5mmol/L、胰島素10mg/L、消炎痛100mmol/L、α-MEM培養液）培養，隔日換液。培養3周后吸棄培養液，PBS清洗，10％中性甲醛固定10min，PBS清洗2次，油紅O染色10min，去離子水清洗3次，鏡下觀察。

2結果

2.1形態學觀察：所篩選細胞大部分呈類梭形，核為卵圓形、位于胞質中央，似成纖維樣細胞（如圖1）。

2.2 細胞生長曲線測定：牙周膜細胞及牙周膜干細胞生長曲線均呈倒“S”形，在接種后1天兩者細胞量均減少，自第2天起，細胞生長均加速，第8天達到生長高峰，進入“平臺期”，此后，細胞生長速度減慢。總體而言，干細胞生長速度明顯低于牙周膜細胞（如圖2）。

2.3 牙周膜干細胞生物學特性研究

2.3.1 克隆形成率：10～12天有細胞克隆形成，鏡下觀細胞呈集落狀生長，細胞形態成梭形，體積較小，排列緊密，中心細胞界限不清，呈圓形或不規則形狀，周邊細胞呈梭形或多角形。共獲得克隆株43株，克隆形成率為14.93％。

2.3.2細胞周期分析：細胞周期動力學結果顯示：大多數細胞處于G0/G1期(78.2％)，即靜止期和DNA合成前期。G2期為2.3％，S期為19.5％。表明細胞增殖緩慢，大多數處于靜止期或緩慢增殖期(如圖3)。

2.3.3 細胞表型特征鑒定：表面抗原CD146和CD44檢測陽性率為92.8％及91.7％，CD34和CD45陽性率為1.6％及2.3％ （如圖4）。

2.3.4 免疫細胞化學染色：篩選培養的牙周膜干細胞中STRO-1及Vimentin均為陽性染色，具有間充質干細胞的特征（如圖5～6）。

2.3.5 成骨誘導：成骨誘導液繼續培養8天后，細胞呈復層生長，局部增厚，12天左右中央出現許多顆粒樣改變，并逐漸連接成片，密度增高。21天左右孔板底部出現肉眼可見針尖大小灰白色小結節，并逐漸增大。茜素紅染色可見紅色礦化結節（如圖7）。

2.3.6 成脂誘導：經成脂誘導液培養至第10天左右，可見細胞形態發生改變，較培養初期更為飽滿，至21天時油紅O染色陽性，細胞胞漿內有大量脂滴形成（如圖8）。

3討論

以往成體干細胞的分離純化常用方法有密度梯度離心法、貼壁培養法、克隆化培養篩選，但這些方法操作繁瑣，且所需時間較長，不利于臨床應用。根據干細胞表面特異性受體能選擇性結合或粘附其它信號分子的原理，采用免疫磁珠篩選、流式細胞分選法分離和鑒定干細胞己廣泛開展[3，9]。Seo[1]的研究結果顯示人牙周膜干細胞表達間充質干細胞的特異性標志STRO-1，并利用免疫磁珠篩選首次成功獲得人牙周膜干細胞。Gay等[4]使用STRO-1抗體對牙周膜細胞進行標記后，通過流式細胞儀對其進行篩選，獲得27％STRO-1陽性細胞。在本實驗中，我們通過使用包被二抗的免疫磁珠對復合STRO-1的牙周膜細胞進行分離純化，獲得牙周膜干細胞，篩選程序簡單、迅速，細胞活性保持較好。經細胞生長曲線測定，牙周膜干細胞較同一來源的牙周膜細胞生長慢，符合干細胞慢增殖周期的特點。

克隆形成能力是干細胞的特點，高秦等[10]對人牙周膜細胞進行了克隆化培養，結果顯示細胞培養10～15天有克隆形成，克隆形成率為0.62％。Gay等[4]對牙周膜干細胞及骨髓基質干細胞的克隆形成情況進行了比較，發現牙周膜干細胞有50個克隆形成，骨髓基質干細胞有35個克隆形成，證實牙周膜干細胞有較強的克隆形成能力。成體干細胞處于由周圍間質細胞及其所分泌的相關生長因子或配體形成的微環境中，這些生長因子或配體與干細胞相互作用，控制干細胞的更新和分化。故為提高克隆形成率并盡可能的保持純化后的細胞的未分化狀態，本研究借鑒了高秦等[10]人牙周膜干細胞克隆化培養的方法，收集了牙周膜細胞的培養上清與普通培養基以一定比例混合，制備成適應性培養基，對所篩選的牙周膜干細胞進行了克隆化培養，共得到43個克隆，克隆形成率為14.93％，證實所獲得細胞具有干細胞自我更新的特性。

細胞周期是反映細胞增殖動力學的重要指標。干細胞是處于相對靜止狀態的一群細胞，這種慢周期的特點是大多數成體干細胞的共同特征[11-12]。但在外界因素作用下，干細胞周期也會相應變化[13-14]。本研究對所篩選牙周膜干細胞的細胞周期分析顯示，與高秦等[10]的結果有一定差異，可能原因有：①細胞來源不同，因不同個體的干細胞狀態不會完全一致；②細胞獲取方法不同，高秦等通過克隆化培養獲取牙周膜干細胞，而本研究采用的是免疫磁珠直接篩選，不同的方法導致細胞所受外界條件刺激的不同，進而可能影響到細胞周期的變化。

目前，學者們還未找到牙周膜干細胞的特異性表面抗原標記物。Seo等[1]的研究結果顯示牙周膜干細胞表達間充質干細胞表面抗原STRO-1及血管周圍細胞表面標記物CD146及CD44。Nagatomo等[15]發現牙周膜干細胞表達細胞表面抗原CD105、CD166及STRO-1。Ivanovski等[16]發現牙周膜干細胞或骨髓基質干細胞均無CD14、CD45和CD34表達。高秦等[10，21]研究結果顯示人牙周膜干細胞波形蛋白（Vimentin）及STRO-1呈陽性表達。在實驗中我們對分離培養的細胞進行了表面抗原測定及免疫細胞化學染色，結果顯示：Vimentin及STRO-l染色陽性，顯示其間充質干細胞來源，此外，流式細胞分析結果顯示間充質干細胞標記物CD44及CD146在牙周膜干細胞中高表達，而內皮細胞標記物CD34，造血系細胞標記物CD45的表達極低，從正反兩方面證實了以往學者的結論。而多向分化研究結果也證實牙周膜干細胞可以經誘導分化為成骨細胞及脂肪細胞，符合干細胞特征。

綜上所述，本實驗所篩選培養的人牙周膜干細胞為多角形、成纖維型細胞外觀，具備克隆形成能力及慢細胞周期特點，免疫細胞化學染色及流式細胞術檢測證實所培養細胞表達CD44、CD146、Vimentin、STRO-1，不表達CD34、CD45，均與文獻報道一致。此外，經誘導培養，所培養細胞可分化為成骨細胞及脂肪細胞，進一步證實牙周膜干細胞具有多向分化能力。

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[收稿日期]2008-04-21[修回日期]2008-05-05

編輯/何志斌