原花青素（ＯＰＣ）抑制紫外線輻射后表皮黑素細胞黑素合成的實驗研究

[摘要]目的：研究葡萄籽提取物原花青素（OPC）對正常表皮黑素細胞以及紫外線輻射后表皮黑素細胞黑素合成的影響。方法：培養的正常表皮黑素細胞和經10mJ/cm2紫外線輻射后的表皮黑素細胞分別以高中低（10、50、100μg/ml）三種濃度的OPC作用72 h，測定細胞增殖率、黑素含量，酪氨酸酶活性。結果：OPC對正常表皮黑素細胞的增殖和黑素合成無明顯影響，但可呈濃度依賴性抑制紫外線輻射后的表皮黑素細胞的黑素合成，并能減輕紫外線輻射對細胞增殖的抑制作用。結論：天然寡聚體OPC對紫外線輻射的黑素細胞有光保護作用，它可明顯抑制紫外線輻射后表皮黑素細胞的黑素合成，而對正常表皮黑素細胞的黑素合成無影響。

[關鍵詞]黑素合成；原花青素；黑素細胞；表皮

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）06-0852-03

Lightening effect on ultraviolet-induced pigmentation of human melanocytes by proanthocyanidin-rich extract from grape seeds

MA Hui-jun1， ZI Shao-xia 2，LIU Wen1， XIE Yan-fei3，WANG Yi-xia1， ZHAO Guang1

(1.Department of Dermatology， Airforce General Hospital of Chinese PLA， Beijing 100036， China.2.Department of Dermatology， Xuanwu Hospital of Capital Medical University， Beijing 100036，China. 3.Department of Dermatology， Hospital of Ophthalmology and Otorhinolaryngology， Botou 062150，Hebei， China)

Abstract:ObjectiveTo study the effects of nature ologomers Proanthocyanidins on the pigment formation by normal human melanocytes and UVR-irradiated melanocytes.Methods Three different concentrations of Proanthocyanidins were incubated with normal human melanocytes and UV irradiated (10mJ/cm2 dose) human melanocytes for 72 h and then melanin content， reactivity of tyrasinase， rate of proliferation were measured.ResultsThere were no effects with melanogenesis and proliferation of normal melanocytes after expose of Proanthocyanidins.However， Proanthocyanidins can decrease the cellular melanin content and reactivity of tyrasinase of irradiated melanocytes with dose-dependent manner. Proanthocyanidins also can protecte proliferation of melanocytes after UV irradiation.ConclusionProanthocyanidins have sun-protection effects on melanocytes. It can inhibite melanogenesis and proliferation of epidermal melanocytes after UV irradiation.

Key words:melanogenesis;Proanthocyanidins;melanocytes; epidermal

原花青素（OPC）是葡萄籽的提取物，具有很強的抗氧化和清除自由基能力，其抗氧化強度比維生素C高10～40倍[1]。在歐美等國家，OPC素來享有“皮膚維生素”，“口服化妝品”等美譽，具有抗皺、美白之功效。但該寡聚體是否能對人表皮黑素細胞黑素合成有一定影響則未見報道。基于此，本文深入研究了OPC對正常表皮黑素細胞和紫外線照射后表皮黑素細胞黑素合成的影響，為探討該天然寡聚體的美白作用提供理論依據。

1材料和方法

1.1 試劑和儀器：MCDB153培養基、二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶、12-O-十四烷佛波脂-13-醋酸酯(TPA)、分離酶(dispase)、霍亂毒素(CT)均為美國Sigma公司產品，噻唑藍(MTT)為美國Amersco公司產品，原花青素粉由藍科恒業醫療科技有限公司惠贈；進口胎牛血清（海克隆生物化學制品有限公司），25cm2塑料培養瓶、96孔培養板為美國Corning公司產品，GS-2004日光模擬器(北京澳華公司)、光輻照度計量儀SUV-5（中國計量科學院）、分光光度計（上海精密分析儀器有限公司）、Clinibio128c酶聯免疫檢測儀（澳大利亞Clinibio公司）

1.2方法

1.2.1 細胞培養：取健康青少年包皮環切手術后的包皮標本，去除皮下組織后剪成1cm×1m的小片，0.50%分離酶4℃放置12～16h，眼科鑷輕輕分離表真皮，用0.25%的胰酶37 ℃消化表皮5～10min，用終濃度用含5%胎牛血清、100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，0.05μg/ml CT， 50nmol/L TPA的MCDB153培養基于37℃、5% CO2條件下常規培養，取傳2～3代純化的表皮黑素細胞(經HMB45單抗免疫組化和Fontana-masson染色證實)，待生長至融合狀態，以0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，臺盼藍染色法計數活細胞數，然后接種至25cm2塑料培養瓶，接種密度為105個細胞/cm2，液體量5ml/瓶。細胞接種24h后，根據實驗分組對細胞進行干預處理，分別用于黑素含量和酪氨酸酶活性測定。

1.2.2 紫外線照射：GS-2004日光模擬器可發出連續紫外線光譜（約含25%UVA和75%UVB，幾乎不含UVC，峰波長為312nm）以模擬自然紫外線照射， 紫外線照射劑量根據文獻結果[2]選定為10mJ/cm2，照射時光源距培養板20cm，垂直照射，經光輻照度計量儀SUV-5測得照射強度為1.0mW/cm2，為避免培養基成分在光輻照下形成的光反應產物可能對細胞產生的影響，照射前用0.1M 滅菌的PBS輕輕沖洗細胞，照射后棄去PBS換為相應的細胞培養基。

1.2.3藥物配制和實驗分組：稱取一定量的OPC融于二甲基亞砜溶液（DMSO）中制成50mg/ml的母液，-20℃保存，臨用時用新鮮培養基調至終濃度。OPC的實驗濃度分別設定為10、50、100μg/ml。實驗分為紫外線輻射+OPC組、紫外線輻射組、OPC組；空白對照組（僅加入等量相應溶媒）；陽性對照組（紫外線輻射+20μg/ml維生素C）。每一處理組分別作用細胞72 h。

1.2.4 MTT法測定細胞增殖：取對數生長期的表皮黑素細胞，消化，計數，將細胞接種于96孔細胞培養板，接種密度為104/孔，液體量200μl/孔，過夜，待細胞貼壁，吸去培養液，用0.1M 滅菌PBS換液，對細胞分別進行紫外線照射、紫外線照射+OPC（10、50、100μg/ml 3個濃度）、單純OPC處理（5、50、500μg/ml），添加相應的培養基后繼續培養72 h，對照組不照光僅加入含等量溶媒的培養基。處理結束時，每孔加5 g/L MTT 20μl，繼續置CO2孵箱培養4h，然后吸去培養液，每孔加入200μl DMSO，充分振搖培養板，用酶標儀測定每孔吸光度A490 nm值。

1.2.5 黑素含量測定：參照文獻[3]的方法稍加改良，收獲細胞，用血細胞計數器進行細胞計數（重復4次取均值），PBS 洗2次，加入200μl的雙蒸水使細胞懸浮，加入1ml的乙醇、乙醚混合液（1:1）室溫下放置15min，然后離心5min(3 000 r/min)，沉淀加入1mol/LNaOH（含10%DMSO）1ml，置80℃ 30 min溶解黑素，加入4 ml雙蒸水將NaOH稀釋成0.2 mol/L，用分光光度計測定黑素的吸光度（A475nm）。黑素含量以（藥物處理組A475/細胞數）/（空白對照組A475/細胞數）×100來表示。每一實驗重復4次。

1.2.6 酪氨酸酶活性測定：參照文獻[3]采用多巴氧化法，酪氨酸酶活性以（藥物處理組A475值/細胞數）/（空白對照組A475值/細胞數）×100來表示。每一實驗重復4次。

1.3統計學分析：所測數據均以x±s表示，采用非配對計量資料t檢驗，統計過程使用SPSS11.0統計軟件完成。

2結果

2.1 OPC對表皮黑素細胞增殖和形態的影響：與空白對照組相比，OPC對體外培養的正常表皮黑素細胞增殖無明顯影響，隨著濃度的增加，細胞增殖略有下降但無統計學差異，細胞形態無變化；10mJ/cm2紫外線照射后細胞增殖有一定降低（P＜0.05），細胞形態表現為胞體增大，折光性減弱，樹突增多、延長；紫外線照射后添加OPC組與照射組相比，細胞增殖有明顯增加（P＜0.05），細胞胞體略小，折光性增強，樹突無明顯增多和延長，該效應以100μg/ml OPC組最為明顯（圖1、2）。

2.3 OPC對表皮黑素細胞黑素含量的影響：OPC對黑素細胞的黑素含量無明顯影響，但可抑制紫外線輻射誘導的黑素合成能力增加，且以濃度依賴方式抑制黑素量的生成，較紫外線輻射組有顯著差異（P＜0.05）。 20μg/ml維生素C也有一定程度抑制紫外線輻射后黑素細胞黑素合成增加的作用，但與紫外線輻射組比較無明顯差異（P＜0.05）。

2.4 OPC對表皮黑素細胞酪氨酸酶活性的影響：與對照組相比，OPC對黑素細胞的酪氨酸酶活性無影響，10mJ/cm2紫外線輻射可明顯增加細胞內酪氨酸酶活性。與紫外線輻射組比較，50μg/ml OPC和100μg/ml OPC組細胞酪氨酸酶活性明顯降低（P＜0.05）20μg/ml維生素C組對紫外線輻射后細胞內酪氨酸酶活性無明顯影響（P＞0.05）。

3討論

OPC是一種大量存在于紅酒和葡萄籽中的多酚類物質，據報道該寡聚體在水溶液和H2O2/NaOH/DMSO溶液中具有極強的抗氧化和清除自由基的能力[4]。Bagchi 等[5]用TPA處理的小鼠為模型進行研究，發現OPC較維生素C、維生素E以及維生素C、維生素E聯合使用均具有更強的清除自由基和抗組織氧化和抗DNA損傷作用。Quevedo等[6]報道紫外線輻射誘導的無毛鼠皮膚中黑素細胞增殖和黑素合成增加作用可以被局部應用抗氧化劑如維生素C和維生素E所減弱。紫外線輻射可誘導體外培養的小鼠角質形成細胞DNA內8-OhdG（由ROS產生的一種DNA的光損傷產物）產生，同時誘導人皮膚中角質形成細胞增殖。因此，ROS在調節黑素細胞和角質形成細胞增殖和黑素細胞黑素合成方面發揮了重要的作用，而ROS產物的清除或抑制劑如抗氧化劑很可能具有減少黑素細胞黑素生成或阻止紫外線誘導的黑素合成增加的作用。基于此，我們對天然抗氧化劑OPC對人黑素細胞黑素合成的影響進行了研究。

既往研究[1]發現原花青素具有抑制B16鼠黑素瘤細胞黑素合成的作用，對黑素合成有直接的抑制作用。而Yamakoshi等[2]研究發現給豚鼠口服OPC可明顯抑制紫外線照射區域皮膚的黑化，而對未照射區域的皮膚顏色無影響，提示OPC可能抑制了皮膚中被紫外線激活的黑素細胞的黑素合成和細胞增殖，而對正常狀態黑素細胞的黑素合成無影響。為了更好的研究OPC對人黑素細胞功能的影響，本試驗將OPC分別作用于正常培養的人表皮黑素細胞和紫外線輻射后的黑素細胞。發現：OPC對體外培養的正常黑素細胞黑素合成無直接影響，但可明顯抑制經紫外線輻射后的黑素細胞的黑素合成，此作用明顯強于另一種抗氧化劑維生素C。MTT法檢測細胞增殖實驗顯示：OPC對細胞增殖無影響，但可改善由于紫外線輻射誘導的黑素細胞的增殖抑制作用。體外細胞酪氨酸酶活性測定結果也證實OPC可抑制紫外線輻射后黑素細胞內酪氨酸酶活性的增加，而OPC本身并無直接抑制人表皮黑素細胞酪氨酸酶活性的作用，上述結果提示我們OPC的美白效應可能主要來源于其對黑素細胞的光保護作用。

眾所周知，一定劑量的紫外線輻射是誘導皮膚黑素合成的強烈的外源性刺激因素，它可通過直接或間接（誘導角質形成細胞釋放多種細胞因子）作用來促進黑素細胞黑素合成和細胞增殖[2，7]。已經證實紫外線輻射可誘導皮膚活性氧自由基（ROS）形成和角質形成細胞產生一氧化氮(NO)，而這兩種物質均具有很強的刺激黑素細胞黑素合成的作用[8]。因此我們推測OPC可能通過抑制上述一種或多種途徑來發揮其美白作用，要想證實上述理論，尚需進一步的實驗研究。

總之，OPC對人黑素細胞具有明顯的光保護和光損傷修復作用，OPC對紫外線誘導的黑素合成有明顯的抑制作用，其作用強于維生素C，具有良好的美白應用前景。

[參考文獻]

[1]Shoji T， Masumoto S， Moriichi N， et al. Procyanidin Trimers to Pentamers Fractionated from Apple Inhibit Melanogenesis in B16 Mouse Melanoma Cells[J]. J Agric Food Chem，2005，53(15):6105-6111.

[2]Yamakoshi J，Otsuka F， Sano A， et al. Lightening effect on Ultraviolet-induced pigmentation of guinea pig skin by oral administration of a Proanthocyanidin-rich extract from grape seeds[J].Pigment Cell Res，2003，16(6):629-638.

[3]馬慧軍， 朱文元， 王大光. 胡椒堿等6種中藥單體促進Cloudman S91黑素瘤細胞株黑素合成的研究[J]. 臨床皮膚科雜志， 2004， 33(3): 145-147.

[4]Yamaguchi F， Yoshimura Y， Nakazawa H， et al. Free radical scavenging activity of grape seed extract and antioxidants by electron spin resonance spectrometry in an H2O2/NaOH/DMSO system[J]. J Agric Food Chem，1999，47(7):2544-2548.

[5]Bagchi D， Garg A， Krohn RL， et al. Protective effects of grape seed proanthocyanidins and selected antioxidants against TPA-induced hepatic and brain lipid peroxidation and DNA fragmentation， and peritoneal macrophage activation in mice[J]. Gen Pharmac 1998，30(5):771-776.

[6]Quevedo WC Jr， Holstein TJ， Dyckman J， et al. Inhibition of UVR-induced tanning and immunosuppression by topical applications of vitamin C and E to the skin of hairless (hr/hr) mice[J]. Pigment Cell Res， 2000，13(2):89-98.

[7] 金頌良，蘇榮健，朱建偉，等.川芎嗪對中波紫外線又到黑素細胞黑素合成的影響[J].中國美容醫學，2006，15（9）:1001-1003.

[8]Romero-Graillet C， Aberdam E， Clément M， et al. Ballotti R. Nitric oxide produced by ultraviolet-irradiated keratinocytes stimulates melanogenesis[J].J Clin Invest 1997，99(5):635-642.

[收稿日期]2008-02-26[修回日期]2008-05-05

編輯/張惠娟