天然羥基磷灰石／殼聚糖復合材料細胞相容性研究

[摘要]目的：評價天然羥基磷灰石／殼聚糖復合材料(nature hydroxyaptite /chitosan composite，NHC )的細胞相容性。方法：人骨髓間充質干細胞誘導法培養成骨細胞，并鑒定。將材料與細胞體外進行復合培養，應用細胞增殖度，堿性磷酸酶和掃描電鏡等對其細胞相容性進行評定。結果：骨髓間充質干細胞誘導的成骨細胞在復合材料表面粘附，生長良好，細胞增殖度無顯著性差異(P＞0.05)，材料組與對照組之間堿性磷酸酶無顯著性差異(P＞0.105)，掃描電鏡觀察發現24h后細胞生長良好，細胞連接緊密，有細胞外基質生成。說明本復合材料具有良好的細胞相容性。結論：NHC具有較良好的體外細胞相容性。

[關鍵詞]羥基磷灰石；殼聚糖；細胞相容性；人骨髓間充質干細胞

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）06-0855-04

Cellular biocompatibility of nature hydroxyaptite/chitosan composite

TANG Xiao-jun1，GUI Lai1，LV Xiao-ying2

（1.Department of Cranio-maxillofacial Surgery， Plastic Surgery Hospital， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100144，China. 2. State Key Laboratory of Bioelectronics， School of Biological Science and Medical Engineering， Southeast University， Nanjing 210096，Jiangsu， China）

Abstract： Objective To investigate the cellular biocompatibility of nature Hydroxyaptite/ Chitosan composite（NHC）.MethodsThe composite was cocultured with osteoblasts derived from human bone marrow stem cells. The cellular biocompatibility was studied by means of the evaluation of proliferation capacity， alkaline phosphatase staining and scanning electron microscope observation.ResultsExcellent adherence and growth of osteoblasts were observed on the composite surface. There were no significant differences in both cell proliferation capacity and alkaline phosphatase staining between the experiment and control groups. SEM observation showed normal growth of osteoblasts and extracellular matrix generation in 24 hours. ConclusionNHC had good biocompatibility with the osteoblasts in vitro.

Key words：hydroxyaptite；chitosan；cellular biocompatibility；human bone marrow stem cells

天然羥基磷灰石／殼聚糖復合材料是由豬骨提取的羥基磷灰石和殼聚糖交聯法獲得的（該材料合成方法已獲得國家專利）[1]。其抗壓強度達到人椎骨水平。理論上本復合材料擁有羥基磷灰石良好生物相容性，引導骨形成，骨融合特性和殼聚糖的體內降解吸收，抗菌抗癌和良好的骨整合等特殊的醫用生物學特性[2]。作為一種新復合成的材料，我們需要對其進行生物相容性評定。該材料骨內植入的掃描電鏡情況已經發表[3]。本文主要是評價該材料在體外的細胞相容性。

1材料和方法

1.1實驗試劑和儀器：1∶50肝素抗凝的正常成人骨髓采自整形醫院臨床患者，經患者知情同意。患者無感染、血液系統、免疫系統疾病等系統性疾患。Percoll（Amershan-Pharmacia公司），低糖型DMEM培養基（Gibco BRL公司），胎 牛 血 清（天津川葉生物公司），青、鏈 霉 素（華北制藥股份有限公司），胰酶（Amershan-Pharmacia公司），二氧化碳培養箱（FORMA 3111型美國），離心機（KUBOTA2100日本），倒置相差顯微鏡（LEICA DM IRB 德國），JSM-T300掃描電鏡，超凈工作臺YJ-875型（北京昌平凈化設備廠 國產），堿性磷酸酶試劑盒（北京中山生物公司產品），骨鈣素RT-PCR引物（賽百盛公司），AMV反轉錄試劑盒（promega），酶聯儀（TECAN SUNRISE日本）。

1.2人骨髓間充質干細胞的分離及培養：正常人1∶50肝素抗凝骨髓5ml，用含10％FBS的L-DMEM 1∶5稀釋離心1200 rpm 5min，去掉脂肪層，重懸細胞。用1.073g/mlPercoll分離，將密度為1.073g/ml Percoll先置于試管的底部，然后按照1∶1的比例緩慢滴加稀釋后的骨髓，離心 2500 rpm 30min，收集位于界面層的單個核細胞。用L-DMEM洗滌兩次，重新懸浮于含10% FBS的L-DMEM培養基中，接種于25cm2培養瓶內，密度為2.0×105/cm2，置于37℃，含 5%CO2的培養箱內孵育。48h后除去非貼壁細胞，更換新鮮培養液。之后每3至4天換一次液。待貼壁細胞生長至90%匯合時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶1比例傳代，第2代以后的細胞按1∶2或1∶3的比例傳代培養。

1.3人骨髓間充質干細胞的鑒定

1.3.1 MTT比色實驗測定細胞生長曲線：用0.25%胰蛋白酶消化單層培養細胞，用含10% FBS的L-DMEM配制成細胞懸液，以每孔1.5×104個的細胞密度接種于96孔板中，每孔體積200μl。將培養板移入CO2培養箱中，在37℃、5% CO2和飽和濕度條件下培養。分別于1、2、4、6、8、10和12天各取出三孔，每孔加入MTT 20μl，37℃孵育4h，中止培養，棄上清，每孔加150μl二甲基亞砜（DMSO），震蕩10min，使結晶物充分溶解，選擇490nm波長，在酶聯儀上測定各孔光吸收值（optical density value OD）。

1.3.2人骨髓間充質干細胞向成骨細胞的誘導分化能力的鑒定。

1.3.2.1 MSC向成骨誘導：取體外擴增的第3代MSCs，以3.0×103/cm2的濃度接種于放置有無菌處理的蓋玻片的六孔板中，每孔內加2ml含10% FBS的L-DMEM培養液。當細胞貼壁生長達到60%～70%匯合時，加入骨誘導劑100nM Dex、0.25mM AsA和 10mMβ-GP，進行誘導培養。對照組只加培養基。在第4、8、12和16天分別觀察各孔中細胞的形態學和組織化學變化情況。

1.3.2.2 堿性磷酸酶活性測定：按堿性磷酸酶試劑盒說明進行操作。取進行誘導后的MSCs的上清液進行測定，分別取4、8、12和16天 4個時間點測定。

1.3.2.3 RT-PCR分析骨鈣素mRNA：人MSC在對照組和含誘導劑培養基中分別培養7天和14天。消化后收集細胞，采用QIAGEN公司的RNeasy mini column 試劑盒提取總RNA。提取后的RNA標本經測定OD 260/280 測定比值為2.0～2.1。取1μg總RNA采用mRNA Selective PCR試劑盒進行RT-PCR反應，方法按使用說明書進行。45℃ 30min反轉錄，各取10μl的cDNA作為模板進行PCR反應，反應條件為：94℃30s，58℃30s，72℃1min，35個循環，72℃延伸10min。產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳。

1.3.3 人骨髓間充質干細胞向脂肪細胞的誘導分化能力的鑒定：將hMSC接種于24孔板中，每孔細胞數為4×104個。24h后添加脂肪細胞誘導液，為高糖DMEM，內含10%FBS、0.5mmol/L異丁基-甲基黃嘌呤、0.2mmol/L吲哚美辛、10-3mmol/L地塞米松、10mg/ml胰島素。誘導2周，每周換液2次。2周后棄去培養基，PBS洗滌3次，10%福爾馬林固定，油紅O染色。

1.4 天然羥基磷灰石/殼聚糖復合材料復合細胞培養：將支架材料制成厚0.2cm，直徑1cm的圓片狀，雙蒸水清洗，室溫下自然干燥24h，紙塑包裝密封，環氧乙烷消毒。

1.4.1人骨髓間充質干細胞（hMSCs）在天然羥基磷灰石/殼聚糖復合支架材料上的貼附實驗：無菌條件下在超凈臺上將消毒的材料圓片放入24孔板，將體外擴增的hMSC經過消化離心，得到細胞懸液，按細胞密度2×l06/cm2均勻接種在材料上。加入含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養基，置入細胞培養箱內培養4～6h。

1.4.2 MTT法分析hMSCs與天然羥基磷灰石/殼聚糖復合支架材料復合培養的成活率和增殖能力：將傳至第3代的細胞以1×104/ml接種于96孔培養板， 每孔加入培養基200μl，37℃， 5%CO2培養箱中培養， 分別于第2、4、6及8天，每孔加入MTT20μl，繼續培養4h，吸出培養液后，加入DMSO液(150μl/孔)，室溫下于微孔板振蕩囂上振蕩10min，使結晶物溶解，在酶標儀上檢測各孔的A值(選擇波長570nm)。統計學方法對所測數據進行方差統計分析。

1.4.3堿性磷酸酶(ALP)活性測定：將支架材料3塊置于六孔培養板，并設3孔為不加材料的空白對照組。將hMSCs以1×105/孔接種于預濕材料上，在條件培養基下(含抗壞血酸、地塞米松和甘油磷酸鈉)培養3周后，收集細胞，采用磷酸苯二鈉法測定樣品ALP活性。

1.4.4掃描電鏡觀察：hMSCs-支架材料復合體標本取出后用2%戊二醛固定，系列丙酮中脫水，乙酸異戊酯置換，臨界點干燥，表面噴金，用JSM-T300掃描電鏡觀察細胞與材料貼附和基質分泌及生長情況。

2結果

2.1采用密度梯度離心法成功分離獲得了MSCs。用密度為1.073g/ml的Percoll對骨髓進行密度梯度離心，經過2，500rpm 30min離心后，分離得到了富含MSC的單個核細胞，將其接種于含10％經過篩選的FBS的培養基中，細胞于48h后貼壁，72h后出現紡錘狀細胞（圖1），6～12天細胞生長迅速，貼壁的MSCs平均約12天后形成克隆（圖2），兩周左右細胞近80%～90%匯合，出現致密的貼壁層（圖3）。

2.2 MSC的生長曲線（圖4）

2.3 MSCs向成骨細胞誘導分化

2.3.1 MSCs向成骨細胞誘導分化過程中的形態學變化：本實驗采用包含有100nM Dex、0.25mM AsA和10mMβ-GP的骨誘導液進行MSCs向成骨細胞定向分化的實驗研究。應用Von Kossa 染色和X光衍射等方法對誘導后的細胞表型進行檢測和鑒定。在16天的誘導過程中，細胞形態發生明顯的變化，與對照組有顯著差別。在進行骨誘導第2天時，細胞形態發生改變，第4天更為明顯，大約30%～40%的MSCs由紡錘狀變為立方型；第8天時，實驗組大約80%以上的MSCs成為立方形或多角形，細胞基質中出現鈣化斑；第12天時，實驗組培養皿中廣泛均一地形成骨樣物質，礦化物形成明顯，并且開始形成多層小結結構；第16天時，成骨誘導組細胞基質形成廣泛的礦化，并形成鈣化結節（圖5）。而對照組細胞形態仍然是紡錘狀。

2.3.2 RT-PCR分析骨鈣素mRNA：RT-PCR分析，在7天、14天時誘導組中骨鈣素的表達明顯增高（圖6）。

2.4 MSCs向脂肪細胞誘導分化：原代培養的MSC呈集落樣增殖，細胞呈長梭形或長三角形，類似成纖維細胞。傳代細胞第3～5代形態逐漸趨于均一的長梭形，核位于中央，細胞分布均勻。誘導36～48h后，光鏡下可見部分細胞沿胞膜下出現環形細顆粒層，折光性較強，細胞核仍位于中央，以后顆粒逐漸增多，并向細胞中央、核周圍逼近，顆粒逐漸變大；細胞仍呈長梭形，但胞體變大和變寬，細胞兩極變短（圖7），油紅O染色證實這些顆粒為中性脂肪顆粒。2～6天后，顆粒細胞明顯增多，分化較早的細胞，在細顆粒增多的同時，顆粒逐漸融合成光鏡下可見的小圓形脂滴，晶瑩透亮，整個細胞內從胞膜到細胞核之間充滿大小較均一的脂滴，呈葡萄串狀(圖8)，胞體明顯變大，并趨于橢圓形。

2.5統計測定

2.5.1 hMSC增殖度測定：隨著培養時間的延長，各組細胞數量都有所增加，各組細胞增殖度差異無顯著性(P＞0.05)。見表1。

2.5.2堿性磷酸酶(ALP)活性：材料組ALP活性為(2.1259±0.1094)，空白對照組為(2.1337±0.1101)，材料組與對照組之間無顯著性差異(P＞0.105)，說明材料對hMSCs進行成骨細胞誘導未見不利的影響，且對誘導的成骨細胞的ALP活性沒有影響。

2.5.3掃描電鏡：材料表面在掃描電鏡下為微粒狀，具有微孔(圖9)。培養4h，細胞附著于材料表面，形態多樣，呈有多個突起的梭形或多角形，細胞間連接松散，細胞跨越微孔表面或向孔內長入(圖10)。培養8h后細胞連接成片，可見細胞表層有絲狀纖維形成(圖11)。培養24h后細胞形成單層結構，細胞緊密，可見到細胞外基質（圖12）。

3討論

細胞相容性是組織工程對支架材料的最基本的要求之一。細胞培養法檢測材料細胞相容性是一種快速、簡便、重復性好又價廉的方法，在材料生物相容性評價中起著越來越重要的作用。體外材料復合細胞培養進行細胞相容性試驗可以排除體內試驗的各種復雜因素之間的相互干擾。可以從細胞水平直接觀察某一單一因素所致的細胞與生物材料復合生長的情況，可以直接觀察細胞對材料的趨化、粘附和細胞在材料表面及內部的生長、增殖和分化。結果較敏感和客觀。

3.1細胞相容性試驗中的細胞選擇：1948年Rosen Bluth等首次報道利用鼠成纖維細胞培養來篩選聚合物，進行細胞毒性試驗評價生物材料的生物相容性的研究。目前一般多選用成纖維細胞株(如L-929)作為實驗細胞[4]。越來越多學者認為不同組織來源的細胞對材料的敏感性是有差異的[5]，應該根據材料植入體內的不同部位及使用目的選擇人體不部位或/和組織來源的細胞實驗細胞，使體外細胞培養對機體內環境的模擬更趨真實，其結果更為準確與客觀。由于我們研究的材料為骨替代材料最終是要被種植到骨組織內，需要長期和骨組織進行生物學接觸。因此骨替代材料應選擇骨組織來源的細胞才能準確反映材料最終在生物體內的真實狀況。比如：成骨細胞，或前體成骨細胞等[6]。

3.2復合材料細胞相容性：材料和細胞相容性有很多的影響因素，比如：金屬材料基質能，表面自由能，界面自由能，材料表面的粗糙程度[7]，材料表面基團種類和結構， 表面電荷， 材料表面的改性和修飾情況等等因素。Baier[8]等認為材料表面的特性和自由能決定其細胞生物粘附性，他們通過在新西蘭白免體內移植幾種不同表面能的金屬材料發現，低表面能材料粘附的細胞呈現球形或近球形，粘附作用極弱。高表面能材料的表面可以被活體細胞完全覆蓋，表面粘附的細胞呈現出扁平、拉長的形態，粘附作用很強。因此高表面能材料的表面更有利于細胞的粘附與鋪展。生物材料表面的化學結構，表面基團或改性修飾對細胞的粘附和生長是另一個重要因素。Lee[9]等認為材料表面不同功能基團具有不同的細胞特性，比如羧基、羥基、磺酸基、胺基、亞胺基及酰胺基等基團可促進細胞的粘附和生長。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）肽表面修飾對HA材料的細胞相容性有明顯的優化作用[10]。并且在生理狀態下，一切脊椎動物細胞表面都帶有分布不均勻的負電荷。因此我們認為帶正電荷的材料表面與帶負電荷的細胞之間的靜電吸引作用有利于細胞的粘附。

在本實驗中，將復合材料和成骨細胞在體外進行復合培養，通過電鏡形態學對材料和細胞復合檢查發現細胞在材料表面生長活躍，培養早期細胞散在于材料表面，呈有多個突起的梭形或多角形，細胞間連接松散。隨培養時間延長，細胞增殖，連接成單層或生長附著于較大孔隙表面，細胞排列緊密，部分區域有細胞外基質形成。即4h細胞貼附生長，8h連成片狀，24h細胞在材料表面形成單層或長入孔隙內，同時有細胞外基質分泌。這說明骨髓基質細胞可以在材料表面貼附生長，并伸入材料之中，可在材料表面及內部伸展和繁殖，保持細胞的梭形形態，并能分泌膠原纖維和鈣離子顆粒等細胞外基質。本實驗也同時應用MTT法對細胞增殖進行檢測，發現與天然羥基磷灰石/殼聚糖復合材料復合培養的骨髓基質細胞其增殖不受影響，表明該材料對骨髓基質細胞的生長分裂無明顯的干擾作用。通過ALP測定進一步檢測該材料對細胞功能狀態的影響，ALP是成骨細胞分化成熟的重要標志，被認為與成骨細胞的分化有密切關系。本實驗顯示，實驗組和對照組ALP活性均有增高，同期比較差異無顯著性。說明這種生物材料不僅對骨髓基質細胞的增殖無明顯阻滯作用，同時對細胞的功能尤其是對于骨髓基質細胞向成骨細胞轉化無明顯影響。由上述實驗結果可得出該材料具有良好的細胞相容性，無細胞毒性。可以作為骨組織工程研究中種子細胞的生物支架。但是這僅僅是在體外短期試驗的結果，該材料在生物體內具體反映如何仍需要進一步的試驗論證。

根據前述的影響生物材料細胞相容性的因素分析，考慮本實驗材料細胞良好相容性與以下因素有關。天然羥基磷灰石具有較高的結合鈣離子的能力，而局部鈣離子濃度的增加，可在材料表面形成高密度的正電荷層，有利于成骨細胞的粘附、生長和增殖。殼聚糖是可降解和可吸收的高分子材料，它表面具有較多的化學基團，可通過調節表面的親水性和本身的生理活性促進細胞的粘附和生長。殼聚糖也是自然界唯一的帶正電荷的多糖，可以和帶負電荷的細胞相互吸引，有利于細胞粘附。該材料的降解性有利于材料與機體之間的物質交換，材料表面殼聚糖成份的降解更為細胞的伸入提供了位置，對形成早期的骨性結合比較有利。從理論上我們推測本材料可能隨著殼聚糖的吸收，成骨細胞長入，骨組織形成逐漸長入、連接并和羥基磷灰石形成骨性愈合，最終實現完全的骨整合。

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[收稿日期]2008-02-26[修回日期]2008-05-11

編輯/張惠娟