Ａ型肉毒毒素對神經和肌肉影響的效價研究

[摘要]目的：探討新鮮和儲存的A型肉毒毒素（BTXA）對神經及肌肉的影響，以期指導臨床治療。方法：將27只新西蘭白兔隨機分成9組，選擇耳前肌為注射部位。第1組為對照組，余8組為注射組。各注射組接受BTXA的注射，大體觀察各組實驗動物右耳下垂的情況；并均于注射后第5天（早期）和第12周（晚期）取注射的肌肉神經行電鏡觀察。結果：大體觀察結果：隨儲存時間的延長，兔耳下垂的時間越短。肌肉電鏡觀察結果：在注射后早期（第5天），新鮮及儲存的BTXA對肌肉的影響無顯著性差異；在注射后晚期（第12周），新鮮及儲存1～2周的BTXA比較，兩者造成的肌肉萎縮程度無顯著性差異，但儲存3周的BTXA造成的肌肉變性程度比儲存1～2周的BTXA輕。神經電鏡觀察結果：BTXA注射后神經改變與上述肌肉改變同。結論：儲存1～2周的BTXA與新鮮BTXA比較，兩者效價基本相同，但儲存3周的BTXA效價下降顯著。并且，新鮮BTXA及儲存1～2周的BTXA對神經肌肉的影響時間較儲存3周的BTXA更持久。因此本實驗建議臨床上儲存BTXA的時間不超過2周。

[關鍵詞]A型肉毒毒素；超微結構；變性；大體觀察

[中圖分類號]R888.8[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）06-0859-05

Study on the effects of botulinum toxin A on muscle and nerve

CHEN Jun-nan，SONG Jian-xing，LI Zhi-hua

（Department of Plastic Surgery， Changhai Hospital， the Second Military Medical University of Chinese PLA， Shanghai 200433，China）

Abstract:ObjectiveThe aim of the study was to compare the effects of fresh and stored botulinum toxin A on muscle and nerve， by means of which the clinical treatment can be instructed.Methods27 New Zealand white rabbits were divided into 9 groups， and anterior auricular muscle was used for injections. Group 1 was used as the control group and the rest 8 groups were used as the injection groups. Each group received the injection of BTXA inspite of the control group. Each rabbit had weekly visual evaluation of the maximum erect static position of the right auricle. Muscles and motor nerves were harvested at 5 days (early period) and 12 weeks (late period) respectively after BTXA injection. Alterations in muscle and nerve ultrastructure were evaluated with electron microscopy.ResultsThe visual evaluation results showed that there was an overall quicker trend to return to baseline the longer the BTXA was stored.Degeneration findings in muscle after botulinum toxin injection revealed no significant difference between freshly reconstituted and stored toxin in the early period (the fifth day). When stored (for 1 and 2 weeks) toxin was used， atrophic changes in the muscle were the same as the fresh toxin at 12 weeks. Muscles of the group which was injected BTXA stored for 3 weeds had less severe degenerative findings than group which was injected with BTXA stored for 1 and 2 weeks muscles. On nerve evaluation， the changes on nerve ultrastructure shows similar degeneration as the muscle.ConclusionIt seems that stored BTXA for 1 weeks and stored BTXA for 2 weeks has the same initial potency， but the duration of action significantly decreased when BTXA was stored for 3 weeks or more. Stored (for 1 and 2 weeks) and fresh BTXA are more durable than the stored BTXA for 3 weeks. Hence， we command that the time for the storage of BTXA should better be shorter than 2 weeks.

Key words: botulinum toxin A；ultrastructure；degeneration；visual study

A型肉毒毒素（botulinum toxin A，BTXA）是由專性厭氧性細菌肉毒梭菌產生的一種神經毒素[1]。它能選擇性作用于外周膽堿能神經，在神經肌肉接頭（即突觸）處[2-3]，抑制突觸前膜釋放乙酰膽堿（Ach）[4]，并阻斷神經遞質的傳遞，從而引起肌肉的松弛性麻痹。

現在市面上使用的肉毒毒素劑型有：美國Allergan公司生產的A型肉毒毒素商品名為BOTOX。英國Speywood公司生產的一種A型肉毒毒素商品名Dysport。我國于1997年正式被國家批準的“注射用A型肉毒毒素”投放市場（97衛藥 準字（蘭）S-01號），商品名為“衡力”。肉毒毒素制造商建議：根據制品特性， 應將BTXA放在-20℃～-5℃冰箱內保存，用生理鹽水稀釋后宜在4h內使用，否則影響效價[5-8]。由于小劑量的BTXA即可產生巨大效應，如此會有相當一部分BTXA剩余，造成制劑的浪費，處理不當更會污染環境。近年來國外一些研究機構對新鮮和儲存BTXA效價進行了對照研究。Gartlan和Hoffman[9]報道儲存BTXA的效價明顯低于新鮮BTXA；另有一些研究表明儲存的BTXA效價未受影響[10-12]。上述研究多是從藥理試驗等方面的影響，幾乎沒有針對神經、肌肉直接作用點方面的研究。儲存的BTXA的效價和作用時間是否受到影響值得進一步深入研究。因此，本實驗針對這方面在動物身上進行實驗，研究新鮮和儲存BTXA對神經肌肉超微結構的影響，以期為今后臨床應用提供可靠依據。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和藥物：A型肉毒毒素由蘭州生物制品研究所研制，商品名為“衡力”，凍干結晶肉毒毒素，規格為100U/瓶，批號：20060602；75%乙醇等化學試劑均購自上海長海醫院。

1.1.2 動物：新西蘭白兔，普通型，健康，雄性，體重1.5～2kg，由上海第二軍醫大學實驗動物中心提供。

1.1.3 儀器：LKB-Ⅱ超薄切片機，瑞士制造；日立H800透射電子顯微鏡，日本制造。

1.2 方法

1.2.1 動物分組：新西蘭白兔27只，實驗前一周購入，單籠喂養，混合飲食，自由飲水與攝食。平均體重為1.80kg。術前常規禁食。房間溫度保持在20℃～25℃。供實驗的動物被隨機分成9組，每組3只，建立對照，各組動物均取右耳注射，左耳為正常參照。具體為：①第1組（n=3，對照組）：取右側耳前肌注射0.05ml生理鹽水；②第2組（n=3）：取右側耳前肌注射新鮮BTXA 0.05ml（2.5 U），注后第5天處死，取標本行電鏡觀察；③第3組（n=3）：取右側耳前肌注射儲存1周的BTXA 0.05ml（2.5U），注后第5天處死，取標本行電鏡觀察；④第4組（n=3）：取右側耳前肌注射儲存2周的BTXA 0.05ml（2.5 U），注后第5天處死，取標本行電鏡觀察；⑤第5組（n=3）：取右側耳前肌注射儲存3周的BTXA 0.05ml（2.5 U），注后第5天處死，取標本行電鏡觀察；⑥第6組（n=3）：取右側耳前肌注射新鮮BTXA 0.05ml（2.5U），注后12周處死，取標本行電鏡觀察；⑦第7組（n=3）：取右側耳前肌注射儲存1周的BTXA 0.05ml（2.5 U），注后12周處死，取標本行電鏡觀察；⑧第8組（n=3）：取右側耳前肌注射儲存2周的BTXA 0.05ml（2.5 U），注后12周處死，取標本行電鏡觀察；⑨第9組（n=3）：取右側耳前肌注射儲存3周的BTXA 0.05ml（2.5 U），注后12周處死，取標本行電鏡觀察。

1.2.2 模型制作：新西蘭白兔耳前肌為注射部位，耳前肌的起始處附著于同側額骨，距離內眥約2cm，止于同側耳朵腹內側肌緣（距耳基底3cm左右），其最小安全劑量為2.5U[12]。實驗組各組動物于注射前腹臥位將其四肢固定于操作臺上。手術前用手術剃刀蘸取肥皂液刮除動物耳周體毛，后用清水沖洗，75%乙醇消毒術區。除對照組，其余各實驗組新西蘭白兔均取右側耳前肌注射BTXA，每安瓿含100U，使用前用生理鹽水2ml稀釋配置成50U/ml。配好制劑即刻注射，剩余儲存于4℃冷藏箱內，儲存時間依次是1、2、3周。

以上實驗動物耳前肌肌肉、神經于注射BTXA后的第5天和第12周做耳前肌處縱行切口，鈍性分離，垂直切斷取出。取下的耳前肌及神經均置于4%多聚甲醛固定4h以上；后將組織用磷酸緩沖液（PBS）0.1mol/L漂洗；鋨酸1%固定2h后用PBS漂洗；梯度（30%、50%、70%、90%及100%）丙酮脫水；用環氧樹脂包埋、聚合等；LKB-Ⅱ超薄切片機切片，最后行日立H800透射電子顯微鏡觀察。

1.2.3 觀察內容：對照組及第6、7、8、9組行大體觀察，每周觀察一次，記錄新西蘭兔耳下垂的情況，兔耳位置分級共分3級，級別依次是第1、2、3級，觀察時間12周。

分別觀察實驗組和對照組的神經、肌肉標本，實驗組與對照組、不同實驗組之間兩兩比較。肌肉萎縮指標包括A-I帶溶解/消失、Z線溶解/消失、細胞核遷移、肌原纖維溶解和肌纖維變性等[13]。神經的華勒(氏)變性指標包括髓鞘松散/溶解、Schwann細胞漿變性、軸索松散/溶解、無髓神經松散/溶解和基質變性等。上述樣本采用半定量評分系統[13]評估變性的數量和程度。未觀察到任何變性計0分；觀察到明顯的變性計5分。

1.2.4 數據分析與統計學處理：對大體觀察結果采用方差和t檢驗（variance and t test）進行統計學處理；應用SAS統計軟件，對電鏡觀察結果采用卡方檢驗（ Kruskal-Wallis Test）進行統計學處理，P＜0.05有統計學意義。

2結果

2.1 大體觀察結果：同對照組比較，注射BTXA的實驗動物（第6～9組）在早期，注射耳均見明顯下垂，等級為第3級（圖1）。之后每周觀察兔耳下垂情況并記錄，連續觀察12周。統計每組的平均恢復時間：第9組的平均恢復時間是5.67周，第8組為7.0周，第7組為8.0周，第6組為9.33周（圖2）。大體觀察結果：BTXA的儲存時間越長，下垂的兔耳恢復越快。2.2 肌肉電鏡觀察結果：①對照組（第1組）的耳前肌肌肉結構正常，無變性表現（P＞0.05）（圖3）；②第2組同第1組比較表現為明顯的肌肉變性（P=0.0027）（圖4）；③第3組同第1組比較表現為明顯的肌肉變性（P=0.0047）；④第4組同第1組比較表現為明顯的肌肉變性（P=0.0047）（圖5）；⑤第5組同第1組比較表現為明顯的肌肉變性（P=0.0046）；⑥第2組同第3組比較，二者肌肉變性程度無顯著差別（P＞0.05）；⑦第3組和第4組比較，電鏡觀察的超微結構變化結果同上（P＞0.05）；⑧第4組比第5組表現為更顯著的肌肉變性（P=0.0486）；⑨第6組（新鮮晚期組）同第1組比較：注射新鮮BTXA 12周后該組耳前肌肌肉仍有變性表現（P=0.0039）（圖6）；⑩第7組同第1組于注射后12周比較，仍見肌肉變性（P=0.0168）；⑾第8組和第1組對比表現結果同上（P=0.0050）(圖7)；⑿第9組和第1組對比表現結果同上（P=0.0168）；⒀第6組和第7組比較，后者肌肉變性的程度較前者輕（P=0.0177）；⒁第7組同第8組比，后者肌肉變性的程度較前者輕（P=0.0486）；⒂第8組同第9組比，表現同上（P=0.0486）。肌肉變性標準評分見表1。

2.3神經電鏡觀察結果：①對照組的耳前肌神經結構正常，無變性表現（P＞0.05）（圖8）；②第2組同第1組比較表現為明顯的神經變性（P=0.0027）（圖9）；③第3組與第1組比較表現同上（P=0.0047）；④第4組與第1組比較表現同上（P=0.0047）（圖10）；⑤第5組同第1組比較表現同上（P=0.0046）；⑥第2組和第3組比較，二者的神經變性無顯著差別（P＞0.05）；⑦第3組和第4組比較，電鏡觀察的超微結構變化結果同上(P＞0.05)；⑧第4組和第5組比較表現為較顯著的神經變性（P=0.0486）；⑨第6組和第1組比較：注射新鮮BTXA 12周后該組耳前肌神經仍有變性表現（P=0.0039）（圖11）；⑩第7組同第1組于注后12周比較，仍見神經變性（P=0.0177）；第8組和第1組對比表現結果同上（P=0.0027）(圖12)；第9組和第1組對比表現結果同上（P=0.0495）； 第6組和第7組比較，兩者神經變性無明顯差別（P>0.05）；第7組同第8組比，結果同上（P>0.05）；第8八組同第9組比，第9組耳前肌神經變性程度輕于第8組（P=0.0046）。神經變性標準評分見表2。

3討論

BTXA為臨床注射用制品，是由極微量的BTXA加入適當保護劑凍干而成，為白色疏松體，用生理鹽水溶解后為無色透明或淡黃色溶液，無雜質及不溶物。臨床上，一般將BTXA保存于-20℃～-5℃冰箱中，以避免其藥物效價受到影響。

迄今，BTXA制品的效價仍用小白鼠體內實驗法測定，即以生物鼠單位來表示。所謂一個單位（U）的BTXA，是指能使腹腔注射的一只18～20g Swiss-Webster 小鼠死亡50%的毒素量，即1只小鼠LD50或簡稱1個單位（U）。

制造商規定：BTXA必須保存在-5℃～-20℃的環境中，使用和操作的過程中應盡可能的保持低溫環境，以減少BTXA生物學活性的損失。新鮮配置的BTXA若未在配后4h內使用，其效價及藥物活性持久度會明顯降低。但近年來，越來越多的研究證實了儲存一定時間的BTXA，其生物學活性未受明顯影響。1993年，Gartlan與Hoffman做過新鮮BTXA和儲存時間分別為6h和12h的BTXA的對比實驗[9]；1996年，Garcia和Fulton也做過類似的對照實驗[14]，將新鮮配好的BTXA與儲存時間依次為1、2和 4周的BTXA對比，通過物理檢查等方法主觀評價了BTXA治療的病人，得出新鮮與儲存BTXA在效價上無明顯差別的結論。1997年，Sloop[10]等人也做過類似實驗，實驗對象為8位病人的指(趾)短伸肌，行肌電圖描記結果，得出新鮮與儲存2周的BTXA的效價無顯著性差異的結論。Jabor[12]等人用新西蘭白兔模型來比較新鮮和儲存BTXA的效價。此項實驗將新鮮BTXA與分別儲存了2、6、12周的BTXA比較，采用電生理學等實驗方法，得出新鮮和儲存的BTXA原始效價基本一樣的結果；儲存12周的BTXA未發現任何細菌污染。

前人做過的皆是有關BTXA功能、生理上的實驗研究，并未有針對BTXA注射后神經、肌肉超微結構變化的實驗研究，且均無明確說明儲存時間與藥物效價、作用時間的關系。參閱以上實驗，并結合大多數醫院藥物儲存條件及藥物活性的改變時間，本實驗著重研究儲存時間在三周內的BTXA，選取大體觀察、電鏡觀察的實驗方法，從神經肌肉的超微結構變化處著手，較直觀的研究了BTXA作用時間及對神經肌肉的影響。

本實驗采用新西蘭白兔耳前肌為實驗模型[12]，理由是位置表淺、注射方便，可直觀觀察其靜態及動態變化。并且，耳前肌是支配兔耳肌肉中唯一可以耐受藥物重復注射的一束單獨的肌肉。已有文獻[15]證實BTXA 的最小有效安全劑量是2.5U，該劑量可造成兔耳耳前肌的完全麻痹。因此，本實驗對照組注射的生理鹽水劑量及各實驗組耳前肌注射的BTXA劑量相同，均為0.05ml。

大體觀察結果：觀察各個實驗組動物的耳下垂情況，并進行等級評估，觀察時間為12周，第9組的平均恢復時間最短，為5.67周，第8組為7.0周，第7組為8.0周，第6組為9.33周。所有實驗組的耳下垂情況在BTXA注射后的第9周均基本恢復注射前的水平。

肌肉電鏡觀察結果：注射新鮮BTXA的肌肉在早期有明顯變性改變，包括胞核移位、固縮；A、I帶及Z線溶解； 肌原纖維溶解；線粒體變性等。新鮮BTXA注射的肌肉超微結構在注射后第12周仍有變性表現，但變性程度輕。說明：新鮮BTXA的效價在注射后3月內對肌肉的影響持續存在，并且以后逐漸恢復。

注射冷藏于4℃的冰箱，儲存時間分別為1、2、3周的BTXA的肌肉改變如下：注射早期（第5天），三者的肌肉萎縮均較明顯，在注射后晚期（第12周）仍有變性表現，但變性程度減輕。說明儲存BTXA在注后12周內對肌肉的影響持續存在，以后呈逐漸恢復的趨勢。

將儲存時間依次是1、2、3周的BTXA同新鮮BTXA比較，表現如下：注射后早期（第5天），新鮮及儲存BTXA的肌肉均有明顯變性的表現；注射后晚期（第12周），儲存1、2周的BTXA與新鮮BTXA比較，兩組肌肉變性程度相似；但是注射儲存3周BTXA后，其肌肉的變性程度較儲存1、2周的BTXA輕，說明儲存3周的BTXA，隨儲存時間的延長，其對肌肉的影響時間越短，變性肌肉恢復越快。

神經電鏡觀察結果：注射新鮮BTXA后神經超微結構有明顯改變，包括髓鞘松散、腫脹；軸突松散；許旺細胞胞漿變性；無髓神經的溶解消失；基質變性等。并在注射后12周仍有變性表現，但變性程度輕，說明新鮮BTXA在注射后3個月內對神經的影響持續存在，并呈逐漸恢復的趨勢。

注射冷藏于4℃的冰箱，儲存時間分別為1、2、3周的BTXA的神經改變如下：注射早期（第5天），三者的神經萎縮均較明顯，在注射后晚期（第12周）仍有變性表現，但變性程度減輕。說明儲存BTXA在注后12周內對神經的影響持續存在，以后呈逐漸恢復的趨勢。

將儲存時間依次是1、2、3周的BTXA同新鮮BTXA比較，表現如下：注射后早期（第5天），新鮮及儲存BTXA的神經均有明顯變性的表現；注射后晚期（第12周），儲存1、2周的BTXA與新鮮BTXA比較，兩組神經變性程度相似；但是注射儲存3周BTXA后，其神經的變性程度較儲存1、2周的BTXA輕，說明儲存3周的BTXA，隨儲存時間的延長，其對神經的影響時間越短，變性的神經恢復越快。

4結論

本課題研究是從BTXA的效價、活性及作用時間的角度出發，設計新西蘭白兔耳前肌的動物模型，應用大體觀察及電鏡超微結構觀察的方法，就新鮮及儲存BTXA對神經肌肉影響進行對照研究，探討BTXA的儲存時間與藥物效價、作用時間的關系。通過大體觀察實驗得出的研究結果表明：隨儲存時間的延長，兔耳下垂的時間越短。通過電鏡觀察實驗得出的研究結果表明：儲存1～2周的BTXA與新鮮BTXA比較，兩者效價基本相同，但儲存3周的BTXA效價下降顯著。并且，新鮮BTXA及儲存1～2周的BTXA對神經肌肉的影響時間較儲存3周的BTXA更加持久。因此，本實驗建議臨床上儲存BTXA的時間不宜超過2周。

[參考文獻]

[1]Jorge OG. Intraoperative injection of bobulinum toxin A into orbicularis oculi muscle for the treatment of crow's feet[J]. Plast Reconstr Surg，2003， 112 (5) Suppl: 151S-157S.

[2]Kuan T， Chen J， Chen S， et al. Effect of botulinum toxin on endplate noise in myofascial trigger spots of rabbit skeletal muscle[J]. Am J Phys Med Rehabil，2002， 81: 512-520.

[3]Lam SM. The basic science of botulinum toxin[J]. Facial Plast Surg Clin North Am，2003， 11: 431-438.

[4]Dimitrova DM， Shall MS， Goldberg SJ. Short-term effects of botulinum toxin on the lateral rectus muscle of the cat[J].Exp Brain Res，2002， 147: 449-455.

[5]Nthony VB. The cosmetic use of Botulinum toxin type A[J]. Inter J Dermatol，1999， 38: 641-655.

[6]Matarasso A， Anand K， Chia C， et al. The plastic surgery educational foundation DATA committee， Borulinum toxin[J].Plast Reconstr Surg， 2002， 109:1191［Follow-up］. Plast Reconstr Surg， 2003， 112 (5) suppl: 62S-65S.

[7]Rohrich RJ， Janis JE， Fagien S， et al. The cosmetic use of botulinum toxin[J]. Plast Reconstr Surg， 112(5):177S-187S， 2003， 112 (5) suppl: 189S-191S.

[8] Cather JC， Cather JC， Menter A， et al. Update on botulinum toxin A for ficial sthetics[J]. Dermatol Clin， 2002， 20:749-761.

[9]Gartlan MG， Hoffman HT. Crystalline preparation of butulinum toxin type A (Botox): Degradation in potency with storage[J]. Otolaryngol Head Neck Surg， 1993， 108:135.

[10]Sloop， R.R.， Cole， et al. Reconstituted botulinum toxin type A dose not lose potency in humans if it is refrozen or refrigerated for 2 weeks before use[J]. Neurology， 1997， 48:149

[11]Garcia A， Fulton JE. Cosmetic denervation of the muscles of facial expression with botulinum toxin[J]. Dermatol Surg， 1996， 22:39.

[12]Jabor MA， Kaushik R， Shayani P， et al. Efficacy of reconstituted and stored botulinum toxin type A: an electrophysiologic and visual study in the auricular muscle of the rabbit[J]. Plast Reconstr Surg， 2003， 111: 2419-2431.

[13]Kilic A， Dingil O， Erkula G， et al. Evaluation of the muscles around the knee in rabbits whose anterior cruciate and/or medial collateral ligaments were dissected[J]. Arch Orthop Trauma Surg， 2004， 124: 626-630.

[14]Garcia A， Fulton JE. Cosmetic denervation of the muscles of facial expression with botulinumtoxin[J]. Dermatol Surg， 1996， 22:39-43.

[15]Elmas C， Ayhan S， Tuncer S， et al. Effect of fresh and stored botulinum toxin a on muscle and nerve ultrastructure: an electron microscopic study[J]. Ann Plast Surg， 2007， 59(3):316-322.

[收稿日期]2008-03-15[修回日期]2008-05-29

編輯/張惠娟