人工唾液浸泡對牙本質(zhì)粘結(jié)界面納米滲漏的影響

［摘要］目的：探討含細(xì)菌的人工唾液對牙本質(zhì)粘結(jié)界面納米滲漏的影響。方法：選用全酸蝕粘結(jié)劑Prime Bond NT(NT)與正常牙本質(zhì)粘結(jié)，制備微拉伸試件。將試件浸泡于含細(xì)菌的人工唾液中，分別在即刻、1周、1月、3月時取出，用掃描電鏡(SEM)觀察粘結(jié)界面銀沉積情況，并用NlH圖像分析軟件量化處理，以界面銀沉積面積占斷裂界面的百分比來評價納米滲漏程度。結(jié)果：粘結(jié)界面在即刻、1周、1月、3月時的銀沉積面積百分比分別為10.97±5.14、12.25±4.01、16.49±4.43、21.03±5.65。結(jié)論：無論浸泡與否，粘結(jié)試件都無法避免納米滲漏的產(chǎn)生；含細(xì)菌的人工唾液浸泡使得粘結(jié)系統(tǒng)粘結(jié)界面納米滲漏增加，并且銀沉積量隨著時間的延長而增大。

［關(guān)鍵詞］人工唾液浸泡；牙本質(zhì)粘結(jié)界面；納米滲漏

[中圖分類號]R783 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2008）06-0867-03

Effects of artificial saliva with bacteria on nanoleakage within resin－dentin interfaces

WANG Jun-cheng1，HAN Shu-feng1，SU Dong-hua1，ZHAO Xin-yi2

(1. Department of Stomatological，The General Hospital of The People's Liberation Army，Beijing，100853，China;2.Stomatological College， The Fourth Military Medical University)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the effects of artificial saliva with bacteria storage on the nanoleakage within resin-dentin interfaces.Methods Prime Bond NT(NT) was bonded with the normal dentin. Matchstick-shaped samples through the bond interfaces were sectioned and immersed in artifical saliva with bacteria. Theresin-dentin interfaces of the the specimens were studied with scanning transmission electron microscopy(SEM) to identify the amount and distribution of silver uptake at 0 day，1 week，1 month and 3 month respectively.They were then subjected to image analysis by NIH Image PC. Leakage scores of each restoration were calculated as the percentage of the total area of the broken interface that was penetrated by silver nitrate. Results The ratios of the silver leakage of the resin-dentin interfaces at 0 day，1 week，1 month and 3 month was 10.97±5.14，12.25±4.01，16.49±4.43 and 21.03±5.65 respectively.ConclusionAII the bonding samples in this study could not resist nanoleakage. After storage in artificial saliva with bacteria， the ratios of the silver leakage within resin-dentin interfaces showed the trend of increase. And the amount of silver would increase as the storage time went on.

Key words:artificial saliva storage; resin－dentin interfaces; nanoleakage

自1994年Sano［1］提出納米滲漏的概念以來，有關(guān)牙本質(zhì)粘結(jié)界面納米滲漏的研究日益增多，并逐漸成為繼微滲漏后粘結(jié)劑邊緣封閉研究的熱點(diǎn)。被粘結(jié)后的修復(fù)體在口內(nèi)要始終處于唾液的包圍之中，因此，唾液及其口腔內(nèi)的細(xì)菌無疑會對粘結(jié)后修復(fù)體的長期穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響。在唾液及其中的細(xì)菌的作用下，牙本質(zhì)粘結(jié)界面的微觀結(jié)構(gòu)會發(fā)生怎樣的變化，目前有關(guān)這方面的研究還相對較少。本實(shí)驗(yàn)采用人工唾液，并在其中加入口腔內(nèi)的常見細(xì)菌來模仿口腔內(nèi)的液體環(huán)境，研究唾液及其中的細(xì)菌對牙本質(zhì)粘結(jié)界面納米滲漏的影響。

1材料和方法

1.1 材料：新鮮拔除的無齲人第三磨牙（拔除后1個月，貯存于4℃生理鹽水中）；復(fù)合樹脂：Chrisma (Kulzer， Germany)(A2色) 批號：052；酸蝕劑：GLUMA Etch Gel(35%磷酸)(Heraeus Kulzer，Germany) 批號：480；粘結(jié)劑：Prime Bond NT(Dentsply， USA)；50%氨化硝酸銀溶液（pH=9.5）：25g硝酸銀（分析純）溶于25g蒸餾水中，滴入28%氨水至溶液重新變澄清為止。EDTA二鈉鹽(分析純)；氫氧化鈉(分析純)；顯影粉(米吐爾，無水亞硫酸鈉)。

1.2 設(shè)備：EZ-TEST500N微拉伸試驗(yàn)機(jī)（SHIMADZU，Japan）；光固化機(jī)：SpectrumTM 800 curing unit (Dentsply，USA)；150低速金剛鋸（中國）；掃描電鏡（JSM-6460，Japan）。

1.3 含細(xì)菌人工唾液的配置：選擇ATCC15987粘性放線菌、ATCC25175 變型鏈球菌、細(xì)菌室的乳酸桿菌作為口腔常見細(xì)菌的代表。菌種經(jīng)純化后，用麥?zhǔn)媳葷峁芘渲瞥?×109/ml，待用。在無菌試管中加入含有培養(yǎng)基的人工唾液3ml（具體成分見表1），每種細(xì)菌加0.1ml，混勻。放入37℃厭氧環(huán)境培養(yǎng)（N2 ：80%、H2：10%、CO2：10%），每3天更換一次。（如圖1）

1.3 試件的制備：選用8個新鮮拔除的人無齲磨牙，用實(shí)驗(yàn)切割機(jī)在流水下垂直于牙體長軸去除牙合面釉質(zhì)，暴露中層牙本質(zhì)，經(jīng)體視顯微鏡觀察無釉質(zhì)殘留后磨平牙本質(zhì)以形成粘結(jié)面，600目碳化硅水砂紙打磨后準(zhǔn)備粘結(jié)[2]。將準(zhǔn)備好的牙按照說明書的要求和步驟使用Prime Bond NT粘結(jié)，然后用復(fù)合樹脂修復(fù)，形成高為4mm的樹脂冠。5min后將粘結(jié)好的牙齒貯存于37℃蒸餾水中。24h后，流水沖洗下用低速鋸沿近遠(yuǎn)中向和頰舌向，垂直于界面將牙齒切割成0.9mm×0.9mm×8mm的條形試件（如圖1）。每個牙齒取6～8個試件，把試件放入無菌試管內(nèi)，加75%乙醇消毒30min，取出用無菌蒸餾水清洗3次，待用。

1.4試件的人工唾液浸泡及界面觀察

1.4.1硝酸銀染色：首先取出10個試件，試件干燥后，除了粘結(jié)界面0.5mm以外，涂兩層指甲油，指甲油干后浸于50%氨化硝酸銀溶液避光保存12h，蒸餾水沖洗后再浸于顯影液中熒光照射8h。然后其余試件分別于1周、1月、3月時分別取出進(jìn)行染色。

1.4.2 SEM觀察斷面銀滲漏程度：用502膠（哈爾濱同林膠粘劑廠）將實(shí)驗(yàn)試件的牙本質(zhì)端和樹脂端固定于特制的試件夾持固定裝置上，通過夾具連接到萬能材料試驗(yàn)機(jī)上(傳感器500N，預(yù)載荷5N)，進(jìn)行拉伸，速度為1mm/min。將試件牙本質(zhì)和樹脂斷端干燥、噴金，用掃描電鏡（SEM）觀察斷面的銀滲漏程度，用NIH圖像分析軟件(Scion， Fredrick， MD，USA)統(tǒng)計界面銀滲漏面積占斷裂界面的百分比，用SPSS軟件對測試結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果

粘結(jié)試件隨唾液浸泡時間在SEM下的電鏡照片如圖2。電鏡（SEM）下，銀滲漏形態(tài)有網(wǎng)狀，樹枝狀和斑點(diǎn)狀，隨著浸泡時間的延長，還有連成片狀的銀沉淀，主要集中在混合層。SEM觀察唾液浸泡前后粘結(jié)試件的銀滲漏面積見表2。唾液浸泡前后，都可以觀察到納米滲漏的存在。唾液浸泡3個月后，試件的銀滲漏面積百分比較浸泡前明顯增大(P＜0.05)，而在1周、1月時試件的銀滲漏面積卻未發(fā)生顯著性變化(P＞0.05)。

3討論

1994年，Sano[1]等用電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)混合層中有特殊物質(zhì)滲入，甚至在無邊緣裂隙形成的情況下都可能發(fā)生。為使之與微滲漏區(qū)分，1995年他提出了納米滲漏的概念。由于納米滲漏的存在，可能使得水、細(xì)菌產(chǎn)物等小分子進(jìn)入粘結(jié)界面產(chǎn)生破壞作用，并且，隨著水分及細(xì)菌代謝產(chǎn)物的進(jìn)入，可能會加速粘結(jié)界面的老化破壞，從而對粘結(jié)的長期效果產(chǎn)生影響。因此納米滲漏成為研究粘結(jié)劑邊緣封閉的熱點(diǎn)。

對于納米滲漏的評價，已經(jīng)從早期的定性研究向定量研究發(fā)展，Li等［3］用銀顆粒占粘結(jié)界面長度百分比度量納米滲漏程度，Okuda等 ［4］用NIH圖像分析軟件檢測銀沉積面積來研究納米滲漏與粘結(jié)強(qiáng)度的關(guān)系。國內(nèi)康彪等［5］將TEM圖像掃描后用NIH圖像分析軟件計算銀沉積(納米滲漏)在混合層中所占面積百分比來評價納米滲漏程度。但是操作過程較復(fù)雜，技術(shù)敏感性高，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大影響。掃描電鏡（SEM）要求樣品厚度一般從幾毫米到數(shù)厘米，且操作相對簡單，且SEM在背散射電子模式下觀察銀滲漏，能獲得更為清晰的圖像。因此本實(shí)驗(yàn)選用SEM觀察斷面。

關(guān)于納米滲漏形成的機(jī)制，目前認(rèn)為全酸蝕粘結(jié)系統(tǒng)需要單獨(dú)使用酸蝕劑處理牙本質(zhì)表面，酸蝕處理可以使玷污層下產(chǎn)生程度逐步遞減的數(shù)微米牙本質(zhì)脫礦層，而目前的全酸蝕粘結(jié)劑由于不能完全封閉牙本質(zhì)脫礦層，從而在混合層和正常牙本質(zhì)基質(zhì)之間遺留有一層直徑約10～50nm多孔性的部分脫礦牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)，這種酸蝕后脫礦的深度與樹脂滲透的深度不一致而導(dǎo)致了納米滲漏的存在。本實(shí)驗(yàn)正是在這些部位觀察到銀離子的大量聚集，驗(yàn)證了這一結(jié)論。并且，在本實(shí)驗(yàn)中無論浸泡人工唾液與否，所有粘結(jié)系統(tǒng)粘結(jié)界面都有納米滲漏產(chǎn)生，表明粘結(jié)系統(tǒng)自身性質(zhì)或操作因素決定了納米滲漏的產(chǎn)生和特征。納米滲漏可成為粘結(jié)界面物質(zhì)交換的場所，水分以及細(xì)菌代謝產(chǎn)物可籍此作用于牙本質(zhì)，進(jìn)而刺激牙髓，可能成為術(shù)后繼發(fā)癥狀的原因之一。

這種雖然在界面沒有明顯裂隙存在卻有能夠讓小分子通過的納米滲漏的存在，使得水能自由通過混合層，水的存在會使得混合層隨著時間產(chǎn)生老化破壞。通常在混合層中存在兩種降解方式：暴露的膠原纖維的降解和膠原纖維網(wǎng)中樹脂的降解。對于全酸蝕粘結(jié)劑而言，由于樹脂單體在酸蝕牙本質(zhì)中滲透時濃度梯度的降低，會在混合層底部產(chǎn)生一個不完全滲透區(qū)，該區(qū)中存在著暴露的膠原纖維[6-8]，并且，隨著水分及細(xì)菌代謝產(chǎn)物的進(jìn)入，可能會加速粘結(jié)界面的老化破壞，從而對粘結(jié)的長期效果產(chǎn)生影響。在本實(shí)驗(yàn)中，界面的銀沉積量不斷的增加，也證明了這一觀點(diǎn)。

國內(nèi)學(xué)者閆晶等[9]研究發(fā)現(xiàn)單純浸泡人工唾液NT在6個月時銀滲漏面積顯著增大，本實(shí)驗(yàn)由于在人工唾液中加入口腔常見細(xì)菌，在細(xì)菌及其產(chǎn)物的協(xié)同作用下，與單純浸泡人工唾液相比，銀滲漏面積的增大速度加快，3個月即出現(xiàn)顯著性變化。說明細(xì)菌及其產(chǎn)物對界面的破壞也起了一定作用。但究竟二者之中，誰起主導(dǎo)作用，還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)中，NT采用濕粘結(jié)技術(shù)，技術(shù)敏感性強(qiáng)，水分控制不容易把握，殘留水分會與粘結(jié)樹脂競爭空間導(dǎo)致固化不全[10]。并且，NT屬于兩步法酸蝕－沖洗粘結(jié)系統(tǒng)。有研究表明，不完全的聚合和粘結(jié)劑滲透性在簡化裝粘結(jié)劑中更突出，兩步法酸蝕－沖洗可能由于高濃度的親水性單體的存在，粘結(jié)界面缺乏非溶媒的疏水性樹脂膜，使得水的存在增加，從而增加了水解破壞作用。

在SEM在觀察銀沉積的位置，對于NT來說，多在混合層底部的脫礦牙本質(zhì)區(qū)，這可能正是由于全酸蝕粘結(jié)系統(tǒng)酸蝕牙本質(zhì)后脫礦的深度與樹脂滲透的深度不一致而導(dǎo)致納米滲漏存在所產(chǎn)生的結(jié)果。

4結(jié)論

4.1無論浸泡人工唾液與否，粘結(jié)試件都無法避免納米滲漏的產(chǎn)生。

4.2 粘結(jié)試件隨著浸泡時間的延長，出現(xiàn)了粘結(jié)界面銀滲漏程度增大，表明人工唾液及細(xì)菌會影響粘結(jié)的穩(wěn)定性，并且表現(xiàn)出協(xié)同作用。

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[收稿日期]2008-04-01[修回日期]2008-04-23

編輯/何志斌