當歸補血湯對大鼠永久性局灶性腦缺血后腦源性促紅細胞生成素的影響

摘 要：目的：觀察當歸補血湯對大鼠永久性局灶性腦缺血的保護作用及對腦源性促紅細胞生成素（erythropoietin， EPO）表達的影響。方法：將動物隨機分為假手術組、模型組和給藥組，采用改良線栓法建立大鼠永久性局灶性腦缺血模型，按缺血時間每組分為4h、1d和7d亞組，給藥組灌胃當歸補血湯。在缺血相應時間后取材，行甲苯胺藍染色，觀察組織病理變化；行TTC染色，計算腦梗死體積百分比；行FluoroJade B（FJB）染色，計算半暗帶陽性細胞數；行EPO免疫熒光染色，計算半暗帶陽性細胞數。結果：與模型組相比，當歸補血湯可以減輕缺血腦組織的病理改變，降低缺血7d亞組腦梗死體積百分比（P<0.05），減少缺血1d、7d亞組半暗帶FJB陽性細胞數（P<0.05，P<0.01）；給藥組缺血1d、7d亞組半暗帶EPO陽性細胞數明顯多于模型組（P<0.01）。結論：當歸補血湯對永久性局灶性腦缺血大鼠具有一定的保護作用，可能與增強腦缺血后腦源性EPO表達有關。

關鍵詞：當歸補血湯；局灶性腦缺血；促紅細胞生成素； FluoroJade B

當歸補血湯出自李東垣的《內外傷辨惑論》，全方由黃芪、當歸組成，為經典的氣血雙補名方。研究表明，它能通過促進腎臟分泌促紅細胞生成素（erythropoietin， EPO）等途徑，刺激造血多能干細胞增殖、分化^［1］。近年來研究發現，EPO及其受體在中樞神經系統也有表達，它們結合后可以增強神經元的缺血耐受能力，在腦缺血后通過促進血管再生、神經干細胞增殖和分化以及抑制神經元凋亡等途徑發揮對缺血腦組織的保護作用^［23］。黃芪或當歸可以通過促進缺血區血管再生、抗氧化損傷、抑制凋亡等機制對缺血腦組織發揮護作用^［56］，但筆者未見文獻報道當歸補血湯對大鼠局灶性腦缺血的作用及對腦源性EPO的影響。本實驗旨在探討當歸補血湯通過腦源性EPO對大鼠永久性局灶性腦缺血的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物

成年雄性SD大鼠，體重250～280g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供（SCXK（軍）2002001）。

1.2 實驗藥物

當歸補血湯：黃芪、當歸兩種單味按5∶1的比例水煎濃縮，終濃度為（30g黃芪+6g當歸/100ml），4℃保存待用。1.3 試劑及主要儀器

試劑：TTC（天津光復）、FluoroJade B（FJB）（Chemicon）、羊抗EPO多克隆抗體、FITC標記的羊抗兔IGg、兔抗羊IGg（Santa Cruz），由天津灝洋公司提供。主要儀器：Leica DMRXA2（德國）， Leica CM 1850冷凍切片機（德國）。

1.4 方法

1.4.1 動物造模及分組

采用改良線栓法制備大鼠大腦中動脈永久性局灶缺血模型。動物清醒后觀察大鼠的行為特征，以動物清醒后出現左前肢不能伸展和爬行時向左側轉圈并存活至規定時間點作為造模成功。假手術組將線栓插入深度15.0 mm，其余步驟同造模組。45只大鼠隨機分為模型組、給藥組和假手術組，根據缺血時間又分為4h、1d和7d組。其中，1d和7d組行TTC染色（假手術組n=1，模型組n=4，給藥組n=4），其余各時間段用4%多聚甲醛（PFA）灌注取腦（假手術組n=1，模型組n=4，給藥組n=4）。給藥組造模前3天開始按1ml·kg-1·d-1灌胃當歸補血湯，假手術組和模型組灌胃同等劑量生理鹽水。置相同固定液后固定24小時，依次浸入20%、30%蔗糖至沉底，行30μm冠狀冰凍切片，1%PFA保存備用（4℃）。

1.4.2 甲苯胺藍染色

甲苯胺藍染色（56℃）5min，用70%乙醇分化，鏡下控制，梯度酒精脫水，常規封片。

1.4.3 FJB 染色

50℃干燥10min，置1%氫氧化鈉5min。依次置于70%、50%、25%乙醇各5min，0.06%高錳酸鉀10min，0.008% FJB 20min（避光），脫水、二甲苯透明，DXP封片，熒光顯微鏡下用綠色濾鏡觀察，呈黃綠色為陽性，取半暗帶不重疊5個（×400）視野。

1.4.4 腦梗死體積測量

腦缺血后1d、7d，迅速斷頭取腦，從額極間隔2 mm連續作6個冠狀切片，采用1.5% TTC染色，正常區域呈紅色，梗死區域為白色，數碼相機拍照后，用圖像分析軟件測量每張腦片的總面積（S總）和梗死面積（S梗死），利用梗死面積比近似等于梗死體積比的原理，計算腦梗死體積百分比^［4］，公式：梗死體積百分比=∑S梗死/∑S總。

1.4.5 免疫熒光染色

采用漂浮法，置于0.5% Triton X-100 10min，正常兔血清或羊血清封閉真空20min，適當一抗（EPO抗體1：50，HIF1 抗體1∶50）4℃孵育過夜，相應FITC標記的IgG（1∶100）室溫真空25min。HIF1 染色后用DAPI（1∶1000）對比染色10min，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察、取圖。

1.4.6 統計學處理

FJB和免疫熒光染色后，每張腦片在半暗帶隨機取5個不重復的（×400）視野。數據采用均值±標準差（x±s）表示。組間比較采用t檢驗，組內比較采用單因素方差分析，P<0.05定義為有統計學意義。

2 結果

2.1 病理學變化

甲苯胺藍染色結果顯示，缺血7天后梗死中心區可見組織明顯稀疏，細胞腫脹，胞核固縮、溶解及神經元細胞丟失。半暗帶內細胞腫脹，部分細胞核固縮、深染。給藥組缺血7d較模型組半暗帶細胞數量缺失不明顯，排列相對規整。

2.2 腦梗死體積百分比

模型組與給藥組缺血1d腦梗死體積百分比無差異（P>0.05），但給藥組缺血7d腦梗死體積百分比小于模型組2.3 FJB染色

模型組和給藥組皮層、紋狀體、海馬等區陽性細胞均可見FJB陽性細胞。給藥組與模型組缺血4h陽性細胞數無差異，但缺血1d和7d，給藥組陽性細胞數均少于模型組（P<0.05、P<0.01）（見表2）。 

3 討論

近年來研究發現，EPO可在中樞神經系統表達，且具有神經保護作用^［3］。Calapaig 等^［5］將沙鼠頸動脈結扎再灌注后腦室內注射EPO，發現缺血后腦組織中丙二醛水平降低、CA1神經元丟失減少。Hugo^［6］等研究發現，在缺血狀態下EPO可以通過JAK2信號通路及VEGF/VEGFR途徑促進血管再生。Bernaudin等^［7］通過向MCAo大鼠腦室內注射EPO，發現神經干細胞的增殖和分化明顯，梗死體積明顯減少。TTC染色結果顯示，模型組與給藥組缺血1d腦梗死體積百分比無差異，但缺血7d給藥組的腦梗死百分比小于模型組（P<0.05）。FluoroJade B（FJB）是一種陰離子熒光染料，Schmued^［8］等發現，FJB可使由多種原因引起變性的神經元著色，與TUNEL染色有著良好的相關性，但比TUNEL染色陽性細胞更廣泛，FJB染色陽性細胞既包括凋亡神經元又包括壞死神經元。FJB染色結果表明，陽性細胞缺血4h最多，然后逐漸減少，模型組和給藥組缺血4h，陽性細胞數無差異，給藥組缺血1d、7d陽性細胞均少于模型組。EPO在假手術組中存在一定量的表達，缺血早期模型組與給藥組表達量迅速升高，模型組與給藥組缺血4h陽性細胞數無差異，但給藥組缺血1d、7d陽性細胞數比模型組多（P<0.01）。可見，當歸補血湯可以改善半暗帶內神經元的生存狀態，從而使半暗帶內變性或凋亡細胞減少，促進缺血后自體的修復功能，縮小缺血7d后腦梗死的體積，這一過程可能與它能增強腦源性 PO表達有關。

本研究利用FJB染色和TTC染色，從細胞和整體水平上驗證了當歸補血湯對大鼠永久性局灶性腦缺血的保護作用，利用免疫熒光染色的方法觀察了腦源性EPO在腦缺血后缺血半暗帶內的動態表達情況。結果提示，當歸補血湯對缺血腦組織的保護作用可能與增強腦源性 PO表達有關。

參考文獻：

［1］ 童延清，侯火明. 當歸補血湯治療貧血機制研究進展［J］.江西中醫藥，2006，37（2）：6263.

［2］ Wang L， Zhang Zg， Wang Y. Treatment of stroke with erythropoietin enhances neurogenesis and angiogenesis and improves neurological function in rats［J］. Stroke， 2004，（35）：17321737.［3］ Buemi M， Cavallaro E， Floccari F. The pleiotropic effects of erythropoietin in the central nervous system［J］. J Neuropathol Exp Neurol， 2003，（62）：228236.

［4］ Calapaig， Marciano MC， Corica F. Erythropoietin protects against brain ischemic injury by inhibition of nitricoxide formation［J］. Eur J Pharmacol， 2000， 401（3）：349356.

［5］ Hugo H. Marti， Myriam B， Edwige P. Neuroprotection and angiogenesis： Dual role of erythropoietin in brain ischemia［J］. News Physiol Sci， 2000， 15（5）：225229.

［6］ Bernaudin M， Marti HH， Roussel S. A potential role for erythropoietin in focal permanent cerebral ischemia in mice［J］. J Cereb Blood Flow Metab， 1999，（19）：643651.

（責任編輯：杜 靖）

Effect of Danggui Buxue Tang on Erythropoietin in

Rats with Permanent FocalCerebral Ischemia

Liu Qiaofei1， Feng chao1， Long Yanyan1， Feng lin1， Che Yongzhe1，2

（1.Nankai university school of medicine， Tianjin 300071， China;

2.Key laboratory of bioactive material of Nankai university， Tianjin 300071， China）

Abstract：Objective：To observe the protective effect of Danggui Buxue Tang （DGBXT） on ischemia brain via brain rooted erythropoietin. Methods： The permanent focal cerebral ischemia model was established by middle cerebral artery occlusion （MCAO）.45 SD rats were enrolled randomly into three groups， sham group， model group， DGBUDgroup； According to the occlussion time， each group was further divided into 4h， 1d and 7d subgroups. Toluidine blue stain to observe the pathologic change； TTC stain and then calculate the percentage of infarction volume； FluoroJade B（FJB）stain to mark degenerated cells and count the FJB positive cells in the penumbra area； Immunofluorescence stain to detect EPO， count the EPO positive cells in the penumbra area. Results： Contrasted to the model group， DGBXD can reduce the infraction volume in 7d subgroup （P<0.05） and the FJB positive cells in the penumbra area in 1d and 7d subgroup（P<0.05， P<0.01）. The EPO expression in the penumbra area of DGBXD groups are significantly higher than that of model group in 1d and 7d subgroup（P<0.01）. Conclusion：DGBXD can protect the ischemia brain， via enhancing brain rooted EPO.

Key words： Danggui buxue decoction； Permanent focal cerebral ischemia； Erythropoietin； FluoroJade B