藥物體外肝代謝研究方法

摘 要：對近幾年的文獻(xiàn)資料進(jìn)行分析、綜合、歸納。介紹肝微粒體體外溫孵法、肝細(xì)胞體外溫孵法、離體肝灌流及器官組織切片法。其中，肝細(xì)胞體外溫孵法是當(dāng)今藥物體外肝代謝研究的熱點(diǎn)，對新藥研究與開發(fā)及正確指導(dǎo)臨床合并用藥有著巨大的推動作用，將對其進(jìn)行重點(diǎn)論述。

關(guān)鍵詞：體外肝代謝；肝微粒體；肝細(xì)胞；離體肝灌流；組織切片

廣義的藥物代謝指藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄等一系列過程^［1］。狹義的藥物代謝是指藥物的生物轉(zhuǎn)化。生物轉(zhuǎn)化后，藥物的理化性質(zhì)發(fā)生變化，從而引起其藥理和毒理活性的改變。因此，研究藥物的生物轉(zhuǎn)化，明確其代謝途徑^［2］，對制定合理的臨床用藥方案，劑型設(shè)計(jì)及新藥開發(fā)工作都具有重要的指導(dǎo)意義。當(dāng)前，國內(nèi)外對藥物代謝的研究主要集中在代謝產(chǎn)物生成和確定代謝途徑。在分子生物學(xué)技術(shù)推動下，藥物代謝酶^［3］領(lǐng)域的研究因其對臨床藥物間相互作用的研究有著積極的推動意義，已得到廣泛的重視。

肝臟是藥物代謝的重要器官，是機(jī)體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的主要場所，富含參與藥物代謝的一個(gè)龐大的依賴細(xì)胞色素P450的混合功能氧化酶系統(tǒng)^［4］，大多數(shù)藥物的Ⅰ相反應(yīng)及Ⅱ相反應(yīng)都依賴于肝臟酶系統(tǒng)而發(fā)生。以肝臟為基礎(chǔ)的體外代謝模型以其特有的優(yōu)勢在藥物代謝研究中得到廣泛應(yīng)用，現(xiàn)概述如下。

1 肝微粒體體外溫孵法

肝微粒體法^［5］是由制備的肝微粒體輔以氧化還原型輔酶^［6］，在模擬生理溫度及生理環(huán)境條件下進(jìn)行生化反應(yīng)的體系，制備肝微粒體一般用差速離心法。

肝微粒體體外溫孵法和其它的體外肝代謝方法相比較，其酶制備技術(shù)簡單，代謝過程快，結(jié)果重現(xiàn)性好，易大量操作，便于積累代謝樣品供結(jié)構(gòu)研究；同時(shí)，該方法可用于對藥酶的抑制及體外代謝清除等方面的研究，因而在實(shí)際工作中應(yīng)用較為普遍。但肝微粒體體外溫孵法同其它體外肝代謝方法相比，在體內(nèi)情況的一致性方面存在不足，因而其實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于預(yù)測體內(nèi)情況仍需進(jìn)一步的確證。

2 肝細(xì)胞體外溫孵法

肝細(xì)胞體外溫孵法同肝微粒體法相似，即以制備的肝細(xì)胞輔以氧化還原型輔酶，在模擬生理溫度及生理環(huán)境條件下進(jìn)行生化反應(yīng)的體系，適于研究蛋白及mRNA水平藥物代謝酶誘導(dǎo)及酶活性，在評估藥物代謝過程中藥物間的相互作用時(shí)，該方法得到廣泛的應(yīng)用。但肝細(xì)胞制備技術(shù)較復(fù)雜，目前以膠原酶灌注技術(shù)為主^［7］，且體外肝細(xì)胞活性僅能維持4h，不利于儲存和反復(fù)使用。

3 離體肝灌流法

離體肝灌流法與肝微粒體法、肝細(xì)胞體外溫孵法相比，一方面保留著完整細(xì)胞的天然屏障和營養(yǎng)液的供給，因而能在一段時(shí)間內(nèi)保持肝臟的正常生理活性和生化功能；另一方面，具有離體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，能夠排除其它器官組織的干擾，可控制受試物質(zhì)的濃度，定量地觀察受試物質(zhì)對肝臟的作用。

Alexandra^［8］等利用離體大鼠肝臟一過式灌流方法研究一種新的抗癌藥BR（苯甲酰胺核糖核苷）的體外代謝，分別以Wistar大鼠與TR2大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，灌流過程中每隔5min取樣1次，監(jiān)測BR及其代謝物，結(jié)果表明，Wistar大鼠灌流液中只有BR及其去氨基產(chǎn)物BRCOOH通過色譜檢測出來，而BAD（苯甲酰胺腺嘌呤雙核苷酸）未檢出TR2大鼠，灌流液的檢測結(jié)果與Wistar大鼠幾乎相同，但在BR與BRCOOH的檢出量上，TR2大鼠組低于Wistar大鼠組18%~23%。同時(shí)，應(yīng)用Wistar大鼠分離肝細(xì)胞，對不同濃度的BR（0~3mmol/L）進(jìn)行了溫孵實(shí)驗(yàn)，通過檢測，BAD仍然無法檢出。通過對BR的離體肝灌流與肝細(xì)胞體外溫孵實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，均發(fā)現(xiàn)BAD低于檢測限，未檢出，這說明BAD這種活性的代謝產(chǎn)物在大鼠肝臟中代謝率很低，BRCOOH為其主要的代謝途徑，故可推測，BR在人體的癌癥治療中，主要代謝生成為BRCOOH。當(dāng)前，離體肝灌流亦應(yīng)用于對藥物的藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行考察。Christian^［9］等運(yùn)用該方法考察了藥物CPT~11在膽汁中的排泄、清除速率及AUC等藥動學(xué)參數(shù)，取得了較好的結(jié)果。離體肝灌流法具有器官水平的優(yōu)勢，兼?zhèn)潴w外實(shí)驗(yàn)和整體動物實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)，更適于定量研究藥物體外代謝行為和特點(diǎn)，并能解決在其它的體外肝代謝模型和整體動物實(shí)驗(yàn)中不能得到滿意解決的難點(diǎn)，在藥理學(xué)和毒理學(xué)的研究中已受到廣泛的重視，但其對實(shí)驗(yàn)設(shè)備及技術(shù)有一定的要求，一定程度上限制了其應(yīng)用。

4 器官組織切片法

器官組織切片法也是研究藥物代謝及其毒性的有效的體外系統(tǒng)，該法不破壞器官的細(xì)胞構(gòu)成和組織結(jié)構(gòu)，所得結(jié)果與體內(nèi)法相近。在各種器官組織切片中，以肝切片的應(yīng)用最多。肝切片相對于純化的P450同工酶、P450混合酶、肝微粒體、游離的肝細(xì)胞來說，不僅完整保留了所有肝臟藥酶及各種細(xì)胞器的活性，而且保留了細(xì)胞間的聯(lián)系及一定的細(xì)胞間質(zhì)，更能反映藥物在體內(nèi)生理情況下的實(shí)際代謝過程，且可在較長的孵育時(shí)間內(nèi)保持代謝活性（可達(dá)8~24h）；其缺點(diǎn)為切片機(jī)的使用受限，而且好的切片機(jī)價(jià)格昂貴。deKanter^［10］等利用利多卡因、睪酮及7乙氧基香豆素為探針?biāo)幬铮M(jìn)行了器官切片溫孵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，該系統(tǒng)具有Ⅰ相及Ⅱ相多相代謝途徑，且易于比較不同器官組織的代謝差別，研究發(fā)現(xiàn)，不同種屬及不同器官間代謝類型及速度不同。

綜上所述，常用的肝體外代謝研究方法有肝微粒體體外溫孵法、肝細(xì)胞體外溫孵法、離體肝灌流法^［11］及器官組織切片法等，廣泛應(yīng)用于藥物的代謝途徑、體內(nèi)代謝清除及藥物間相互作用的研究，應(yīng)根據(jù)不同的要求和目的選擇應(yīng)用。體外肝代謝研究可針對先導(dǎo)化合物代謝過快或生成毒性代謝物^［12］的特性進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，以獲得安全穩(wěn)定的候選物，根據(jù)候選物的代謝特征（如藥酶誘導(dǎo)抑制參與代謝的藥酶種類、活性代謝物的生成等）確定藥物的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。今后，隨著研究的不斷深入，藥物體外肝代謝^［13］的研究將不斷完善，進(jìn)一步發(fā)揮其價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：杜 靖）