遠程氧等離子體對大腸桿菌的滅菌效果與機理研究

摘 要：采用Langmuir雙電子探針和電子自旋共振診斷技術(shù)分別定量測定了遠程氧等離子體場中各活性物種的分布，考察了遠程氧等離子體對醫(yī)用聚四氟乙烯表面大腸桿菌的滅活作用，并通過對滅菌后菌懸液蛋白質(zhì)泄漏量、脂質(zhì)過氧化物生成量及細菌DNA電泳圖的測定分析了其滅菌機理，結(jié)果表明：遠程氧等離子體中的電子、離子濃度隨遠程距離的增大迅速降低，30cm后接近于0，而自由基濃度則相對降低緩慢，40cm處仍為初始濃度的70％；遠程氧等離子體60s內(nèi)的滅菌效果值在放電區(qū)可高達3.42，在遠程距離40cm以內(nèi)也均在3.32以上，符合消毒滅菌的要求；電子、離子對細菌細胞膜的快速刻蝕及自由基對胞膜申多價不飽和脂肪酸的攻擊分別是放電區(qū)及遠程30cm后滅菌的主要原因，氧等離子體中紫外光的滅菌效果微弱。

關(guān)鍵詞：遠程氧等離子體；大腸桿菌；滅菌

中圖分類號：R18 文獻標志碼：A 文章編號：0253-987X(2008)01-0096-05

近年來，對應(yīng)于臨床醫(yī)學(xué)和人類生存環(huán)境的要求，低溫等離子體滅菌以其具備的快速、低溫、無損材料基質(zhì)、干式無污染等特點實現(xiàn)了滅菌技術(shù)的“綠色化”，在消毒醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、軍事等領(lǐng)域中的應(yīng)用研究引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，被認為是新一代最有前途的滅菌技術(shù)，但是，迄今為止，關(guān)于其滅菌機理的研究，仍停留在只是以等離子體場中活性物種混存下的表觀反應(yīng)結(jié)果為依據(jù)作出的推測，尚未能建立起具有普遍說服力的滅菌機理，究竟等離子體中各活性物種在滅菌中各自起著何種作用，貢獻份額多少，仍然是等離子體滅菌基礎(chǔ)理論研究中亟待解決的問題，據(jù)此，我們提出利用遠程等離子體場，以實現(xiàn)其活性物種(電子、離子、自由基)的有效分離，從而解明它們各自在滅菌中的作用規(guī)律。

本文采用Langmuir雙電子探針和電子自旋共振(ESR)波譜儀對遠程氧等離子體的活性物種分布進行了定量測定，考察了遠程氧等離子體對大腸桿菌的滅活作用，并通過對滅菌后菌懸液蛋白質(zhì)泄漏量、脂質(zhì)過氧化物——丙二醛(MDA)生成量及細菌DNA電泳圖的測定，分析了遠程氧等離子體的滅菌機理。

1 材料與方法

1．1 實驗裝置

如圖1所示，自行研制的遠程等離子體反應(yīng)器由進氣系統(tǒng)、反應(yīng)室、抽氣系統(tǒng)和射頻電源及電極組成，射頻電源為SY-500型晶控射頻功率源，頻率為13.56MHz，輸出功率連續(xù)可調(diào)，與SP-Ⅱ型射頻匹配器配合，采用電感耦合放電方式，通過調(diào)整電感耦合可使電源反射功率接近于0。反應(yīng)室為長1m、直徑為45mm的硬質(zhì)玻璃管，在感應(yīng)線圈處放電，在準理想管式反應(yīng)器中，等離子體沿一維方向向遠端擴散，形成遠程等離子體。

1．2 實驗方法

1．2．1 Langmuir雙電子探針與ESR診斷 將Langrnuir探針導(dǎo)桿與等離子體反應(yīng)器相連，探針位置可調(diào)，通過函數(shù)記錄儀獲得探針兩端電壓與流經(jīng)探針電流之間的伏安特性曲線，從而求得等離子體空間的離子濃度。

以清潔天然羊毛為等離子體自由基捕捉劑，置于距電感線圈中點不同距離處的載物板上進行處理，處理后試樣常溫保存24h，采用ESR波譜儀(BRUKER公司，ESP－500型)進行自由基濃度測定，測定條件：室溫，微波頻率9.8GHz，微波功率3.177mW，調(diào)制幅度0.2mT，調(diào)制頻率100kHz，時間常數(shù)163.84ms，增益60，掃描時間163.84ms。

1．2．2 載體定量滅菌實驗 大腸桿菌(Escherichiacoli，ATCC 8099)為本實驗室保存菌種，凍干菌科融化后，復(fù)蘇劃線接種于營養(yǎng)瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司)培養(yǎng)基平板，挑取典型單菌落，接種斜面37℃培養(yǎng)過夜，將5mL PBS緩沖液加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔，將菌懸液移至另一無菌試管中，振蕩使細菌懸浮后，用細菌濃度比濁管來粗測其含菌濃度并配制成每毫升含10⁵～10⁸菌落數(shù)的菌懸液，取0.01mL該菌懸液均勻涂于25mm×25mm醫(yī)用PTFE膜(阜新氟化學(xué)有限責(zé)任公司制造，厚度20μm，預(yù)先進行脫脂、漂洗并經(jīng)高壓蒸汽滅菌)表面，晾干，實驗時，先將一部分染菌樣片直接置于距電感線圈中點不同距離處的載物板(預(yù)先清洗干凈并烘干滅菌)上，在不同放電功率、處理時間、氧氣流量下進行處理；再將另一部分染菌樣片置于LiF小瓶(預(yù)先清洗干凈并烘干滅菌)內(nèi)，放人遠程氧等離子體場中不同位置進行處理，放電氣體為氧氣(梅賽爾北方工業(yè)氣體有限公司)，其純度(體積分數(shù))高于99.99％，處理后的樣片(陽性對照不經(jīng)處理)經(jīng)充分振蕩洗脫成菌懸液，取樣進行活菌培養(yǎng)計數(shù)，滅菌效果(germicidal effect，GE)以E表示，按下式計算

E=lgN₀-lgN_t式中：N₀為陽性對照組樣品生長菌落數(shù)；N_t為實驗組樣品生長菌落數(shù)。

1．2．3 泄漏蛋白質(zhì)含量的測定 將直接經(jīng)等離子體處理后的樣片放入PBS溶液中，振蕩洗脫為菌懸液，離心取上清液與質(zhì)量濃度為100mg/L的考馬斯亮藍G-250(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)溶液混勻，室溫靜置3min，于波長595mm處比色測吸光度，將樣品液的吸光度值帶入牛血清白蛋白(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)標準曲線回歸方程求得泄漏蛋白質(zhì)濃度。

1．2．4 MDA的測定 利用MDA測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，將1．2．3小節(jié)中洗脫的菌懸液離心取上清液，于532mm波長處比色測吸光度，按下式計算其中MDA的濃度

c(MDA)＝(A_m-A_mo)/(A_s-A_so)×10^-5×n式中：c(MDA)為樣本中MDA的濃度(mol/L)；A_m為測定管的吸光度；A_mo為測定空白管的吸光度；A_s為標準管的吸光度；A_so為標準空白管的吸光度；n為樣本測試前的稀釋倍數(shù)。

1．2．5 DNA瓊脂糖電泳測定 用1．2．3小節(jié)中洗脫的菌懸液用離心柱型細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN生物技術(shù)有限公司)進行DNA提取，在ECP3000型電泳儀(北京市六一儀器廠)上進行DNA測定，電泳緩沖液TBE(Tris-硼酸鹽緩沖液)的工作濃度為50mmol/L，工作pH值為7.5～7.8。

實驗中所用化學(xué)試劑均為分析純。

2 結(jié)果與討論

2．1 遠程氧等子體中活性物種的分布

圖2所示為在遠程氧等離子體中采用Lang-muir雙電子探針和ESR測定的電子、離子和自由基的分布狀態(tài)，從圖中可以看出：在同一功率下，電子、離子濃度隨遠程距離的增大迅速降低，在30cm后趨近于0，自由基濃度則逐漸降低，在40cm處仍為初始濃度的70％，這是因為遠程等離子體場中各活性物種(電子、離子、自由基)的存活壽命不同(電子-離子再結(jié)合與自由基-自由基再結(jié)合的反應(yīng)速度常數(shù)分別為10^-7cm³/s和10^-33cm⁶/s的數(shù)量級)，沿氣流方向在距放電區(qū)一定距離處可獲得電子、離子與自由基的分離。

2．2 遠程籌子體處理條件對滅菌效果的影響

圖3～圖6分別表示不同距離、放電功率、時間、氧氣流量對滅菌效果的影響，由圖3可知，遠程氧等離子體的E值在放電區(qū)可高達3.42，在遠程區(qū)(≤40cm)也均在3.32以上，完全符合消毒滅菌的要求，由于遠程區(qū)電子、離子的相對濃度趨于0，因此在滅菌的同時還可有效抑制其對染菌載體表面的刻蝕，增強自由基反應(yīng)，這一點對醫(yī)用材料來講尤為重要。

由圖4可知，距放電中心40cm內(nèi)，隨著功率的增大，滅菌效果均呈波動式變化，在達到80W后則迅速增強，這是由于功率增大時。定量氧氣分子獲得的能量增大，則氧氣的電離度以及活性粒子的平均能量增高，使得活性粒子對細菌的作用概率和強度增強，從而增加了滅菌效果，實驗確定，遠程氧等離子體的最佳滅菌功率為100W。

由圖5可知，距放電中心40cm內(nèi)，處理20s后，滅菌效果迅速增強，達50～60s后趨于穩(wěn)定，這是因為隨著處理時間的延長反應(yīng)程度快速增加，60s后反應(yīng)接近完全，即氧等離子體可在短時間內(nèi)有效殺滅大腸桿菌，實驗確定，遠程氧等離子體的最佳滅菌時間為60s。

由圖6可知，距放電中心40cm內(nèi)，滅菌率均隨氣體流量的增大先增大后降低，這是因為隨著氣體流量的增大，氧原子的密度同步提高，但由于維持功率不變，即放電區(qū)的射頻磁場和電場強度基本不變，則等離子體的電離度就隨氣體流量的增大而下降，使得活性粒子對細菌的作用概率和強度減弱，從而使滅菌率下降，綜合考慮各實驗條件，確定遠程氧等離子體滅菌的適宜氣體流量為40cm³/min。

2．3 遠程氧等離子體滅菌機理的研究

圖7和圖8分別是滅菌后菌懸液中蛋白質(zhì)泄漏量和MDA生成量隨遠程距離的變化曲線，由圖7可知，在一定條件下，遠程距離增加，蛋白質(zhì)泄漏量逐漸降低，在20～40cm內(nèi)維持相對穩(wěn)定，之后又快速下降，這是因為放電區(qū)電子、離子對細菌表面強烈的刻蝕作用導(dǎo)致細胞膜的破裂，胞質(zhì)內(nèi)容物流出，之后隨電子、離子濃度迅速下降，在30cm后形成相對高濃度的自由基氛圍，刻蝕作用得到抑制，與圖3的滅菌曲線對比可知，電子、離子對細菌表面強烈的刻蝕作用是放電區(qū)大腸桿菌死亡的主要因素。

由圖8可知，放電區(qū)MDA的生成量逐漸增加，這是因為放電區(qū)電子、離子的快速刻蝕抑制了自由基的作用，而在遠程30cm后，MDA的生成量快速增加則表明遠程區(qū)細菌的滅活主要是靠自由基攻擊細胞膜中的多價不飽和脂肪酸(PUFA)生成MDA，引起細胞損傷或細胞代謝及功能障礙而最終死亡，

圖9為100w、60s、40cm³/min、45Pa條件下滅菌前后的大腸桿菌DNA瓊脂糖電泳圖，從圖中可以看出，DNA僅在遠程距離40cm及60cm處有一定程度的拖尾，在其他位置幾乎沒有拖尾現(xiàn)象，說明在放電區(qū)，氧等離子體中的活性物種——紫外光幾乎沒有發(fā)生作用，而在遠程區(qū)，紫外光也僅是協(xié)同自由基完成滅菌，并非主導(dǎo)因素，這是因為射頻低溫氧等離子體中紫外光波長雖然介于140～360nm之間，但只有波長小于196nm的紫外光子才能夠有效打破C=C和C=N雙鍵，波長大于220nm的紫外光子殺菌效果微弱。

圖10為100w、40cm³/min、45Pa條件下，樣片置入LiF小瓶(λ≥120mm的紫外光子可通過內(nèi)經(jīng)等離子體處理與樣片直接經(jīng)等離子體處理后的滅菌效果比較，也表明了氧等離子體中紫外光在大腸桿菌的滅活過程中作用微弱。

3 結(jié) 論

當放電功率為100w、處理時間為60s、氧氣流量為40cm³/min、真空度為45Pa時，遠程氧等離子體在距放電中心40 cm以內(nèi)對醫(yī)用PTFE表面的大腸桿菌均可有效滅活，由于遠程區(qū)(≥30cm)電子、離子的相對濃度趨于0，因此在滅菌的同時還可有效抑制其對染菌載體表面的刻蝕，增強自由基反應(yīng)，從而實現(xiàn)可控性等離子體滅菌技術(shù)。

對氧等離子體滅菌機理的研究表明，放電區(qū)的滅菌是電子、離子對細胞膜的快速刻蝕作用的結(jié)果，此時氧等離子體中的自由基及紫外光作用微弱，而在遠程30cm后，隨著電子、離子濃度的迅速降低，形成了一個相對較純的高濃度自由基氛圍，其對胞膜中PUFA的攻擊成為導(dǎo)致細菌死亡的主要原因，此時紫外光在一定程度上攻擊細菌的DNA，導(dǎo)致DNA損傷及斷裂，與自由基協(xié)同完成滅菌過程，但并非主要因素。

(編輯 荊樹蓉 趙大良)