越橘葉斑病原菌的拮抗菌篩選及其發酵條件優化

摘要：從黑松林地土壤中分離得到一株對越橘葉斑病原菌Cylindrocladium colhounii有較強抑制作用的細菌B7。建立該細菌的生長曲線。采用菌絲生長抑制法，研究了該細菌對C.colhounii的拮抗作用，并通過正交試驗優化了其發酵條件。結果表明，該菌體在培養了5 h后即進入對數生長期；B7細菌的發酵液原液和無菌濾液均能抑制病原菌的生長，其中發酵液原液的10³稀釋液的抑菌效果仍與對照之間存在顯著的差異；發酵條件優化試驗中發現該細菌的無菌濾液最大抑菌率達100％，最佳發酵條件為葡萄糖0.5％、氯化銨0.1％、不加無機鹽、pH 5.4，溫度28℃；結合形態學特征和16S rRNA的序列分析，將該菌株鑒定為枯草芽孢桿菌。

關鍵詞：越橘；Cylindrocladium colhounii；枯草芽孢桿菌；正交試驗；16S rRNA

中圖分類號：S436.631.1；S476 文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980(2008)03-426-05

越橘，作為保健和功能食品，已被國際糧食組織列為人類五大健康保健食品之一，市場前景喜人。近年來，在山東、江蘇、遼寧等地開始了大面積的栽培生產，規模正在不斷擴大，已成為最具發展潛力的果樹樹種之一。與此同時。由于環境條件的影響，病蟲害開始出現。本實驗室在遼寧大連和丹東的越橘種苗繁育基地發現了一種為害較為嚴重的葉斑病害，給生產造成了巨大的經濟損失。經分離鑒定，確認該病的致病菌為Cylindrocladium colhounii。此前，有報道認為該菌能引起雞冠花的褐腐病、鶴望蘭的葉斑病。同時該菌能危害花生、大葉桉、紅葉層、鹿蹄草等多種觀賞類植物。

利用拮抗細菌防治果樹真菌性病害的報道已有很多。然而，對于C.colhounii菌的生物防治一直沒有相關的報道。2006年，我們用銀杏外種皮提取物抑制該病原菌，取得了很好的效果。但由于所需的原材料價格偏高且來源較少，不適合大規模生產。作者旨在篩選出有較強且穩定抑制作用的拮抗菌株，并從碳源、氮源、無機鹽、溫度及pH值等方面對其發酵條件進行優化，為進一步的生物防治，尤其是微生態防治奠定基礎。

1 材料和方法

1．1 培養基

細菌的分離、純化分別采用PDA和BPY培養基，種子培養基為液體BPY。

正交試驗中各種發酵培養基的組成參照BPY確定為碳源0.5％、氮源0.1％、無機鹽0.5％，pH設置4個梯度。

1．2 供試病原菌株

真菌病原菌株C.colhounii由本實驗室從發病的越橘植株中分離鑒定，作為指示菌。

1．3 土樣采集與拮抗菌株的分離篩選

2006年4月于大連理工大學的多年生黑松樹林內，采用5點取樣法，采集根際區域表層15 cm以下土壤，取各土樣42 g加入裝有200 mL無菌水的三角瓶中，放入玻璃珠振蕩30 min，將懸濁液依次稀釋10、10²、10³、10⁴、10⁵倍。在分離培養基正中間放置一直徑為7 mm的指示菌菌餅，在距指示菌菌餅邊緣1.5 cm處對稱的放置4片直徑為1 cm滅菌圓形濾紙片，其上滴加1 mL的懸濁液。每個濃度3次重復。待長出菌落后，挑取對指示菌有明顯抑制作用的菌落，進行劃線純化。將純化后的單菌落移至BPY斜面上，37℃培養。

1．4 拮抗細菌生長曲線的繪制

參照周德慶的方法，將菌液稀釋5倍后測量、繪制菌體的生長曲線。

1．5 發酵液抑菌活性的測定

10 pmol，ddH²O補足至50μL。擴增條件為94℃預變性5 min，94℃變性30 s、53℃退火30 s、72℃延伸90s，共30個循環，最后72℃延伸8 min。取4 μL擴增產物，用1.0％的瓊脂糖凝膠進行電泳：產物測序由TaKaRa(大連)公司完成。通過NCBI數據庫搜索與測序結果相近序列對該菌株進行初步鑒定。

2 結果與分析

2．1 菌種的篩選

經過反復的篩選，從16株細菌中分離純化到了1株抑菌效果較好的細菌，命名為B7。并將該菌種于70℃條件下保藏，備用。

2．2 菌體生長曲線的繪制

根據該細菌在BPY中不同培養時間的D_600nm值繪制了菌體生長曲線(圖1)。可以看出，培養5 h后菌體進入對數生長期。9 h后進入穩定期。12 h后進入衰退期。由此初步判定要收集菌體或抑菌物質，應在細菌培養12 h后進行。

2．3 發酵液抑菌活性的測定

B7細菌搖瓶培養16 h后測定其菌體密度，稀釋5倍后D 6G0nm為0.64。B7細菌發酵液無菌濾液及不同濃度發酵液原液對C.colhounii菌絲生長的影響狀況及其各自的抑菌率列于表2。可見，對于不同濃度的發酵液原液，所有的處理均有抑制病原菌的作用，其中發酵液原液稀釋10²倍后的抑菌效果與其原倍液差異不顯著，而稀釋10²倍后菌體生長直徑與對照組之間仍有顯著的差異，這充分證明發酵液原液有較好的抑菌效果；對于發酵液的無菌濾液，抑菌率為86，6％，這與發酵液原倍液及其lO倍稀釋液的抑菌效果相當，由于此處理消除了菌體競爭作用抑菌的影響，故證明了發酵液中確實存在抑菌物質。綜上可知，發酵液原液和發酵液的無菌濾液均對病原菌有較好的抑制作用，但各處理的抑菌率未達到100％，所以考慮優化發酵條件以提高其抑菌率。

2．4 拮抗細菌發酵培養條件優化

16個處理中的最佳發酵組合為葡萄糖O，5％、氯化銨0，1％、不加無機鹽、pH 5，4、培養溫度28℃，其24 h發酵液的無菌濾液抑菌率可以達到100％(圖2)，與之前的發酵條件相比，無菌濾液的抑菌效果顯著提高(圖3)，故將此作為該菌的最佳發酵條件：極差分析結果表明各因素對發酵產物活性大小的影響順序為溫度>碳源>氮源>無機鹽>pH：方差分析結果顯示溫度和碳源對發酵產物活性的影響達到了極顯著，氮源和無機離子達到了顯著，pH值的影響不顯著。

2．5 拮抗細菌的鑒定

在BPY固體培養基上菌落形態、大小、顏色均勻一致，都長成了圓形黃色的單菌落，表面干燥無光、呈褶皺狀。邊緣整齊，菌落扁平且不透明。在BPY液體培養基中，菌液均勻渾濁，試管底有菌體沉淀產生。液面無菌膜。生長了24 h的B7細菌。經結晶紫染色在鏡下菌體呈桿狀，大小為1.86μm×1.04 μm，有較少的芽胞形成。革蘭氏染色為陽性。

將PCR擴增得到的特異性產物進行測序，得到長度為1466 bp的片段(已提交GenBank)，將該序列在GenBank中進行BLAST比對，發現與已報道的2株Bacillus subtilis (登錄號：DQ520955)

3 討論

20世紀90年代以來，由于化學防治方法的弊端愈加突出，人們逐漸將目光轉向生物防治，尤其是對于像越橘這樣以食用果實為目標的作物，更顯得重要。有益微生物是人們關注的一個焦點，其中芽孢桿菌作為植物微生態防治的優勢種群，具有較強的抗菌防病作用，已成功地用于植物病害的生物防治，而且很多已經作為生物農藥廣泛應用。而利用生防細菌對越橘葉斑病原菌C.colhounii進行防治一直沒有相關的報道。本實驗首次將枯草芽孢桿菌用于該病的生物防治，并且取得了較好的防治效果。

本研究篩選出的生防細菌B7，無論是其不同濃度的發酵原液或是無菌濾液均對病原菌C.colhounii有較好抑制作用，證實了該菌分泌了抑菌物質。但實驗中我們發現發酵原液的無菌濾液的抑菌作用要好于發酵原液，而在發酵條件優化后其抑菌率更是能夠達到100％。這一結果與之前的報道很相似，分析其可能的原因主要有兩方面。第一，優化后的發酵條件更有利于該細菌產生抑菌物質：第二，發酵時間適當延長，產生的抑菌物質增多。

我們已有利用植物源提取物抑制病原菌C，col-hounii的報道。但比較而言，本實驗采用的微生物防治方法在達到相同抑菌效果的基礎上更有其自身的特點，比如原料來源廣泛，使用方便。污染更小，生產周期短以及抗逆能力作用很強等。此外，本研究篩選的菌株源于土壤，具有較強的生物安全性。最后，B7細菌發酵條件的優化實驗結果表明，該菌對pH值的適應范圍較廣，而溫度和碳源對其產生抑菌物質的影響顯著，故實際生產中應著重考慮這2個因素，以得到最佳的發酵效果。

4 結論

篩選得到一株對越橘葉斑病原菌C.colhounii有較強抑制作用的細菌(B7)，經形態學特征和16SrRNA的序列分析，將該菌株鑒定為枯草芽孢桿菌。B7細菌的發酵液原液和無菌濾液均能抑制病原菌的生長，發酵條件優化后該細菌的無菌濾液最大抑菌率達100％。該菌的最佳發酵條件為葡萄糖0.5％、氯化銨0.1％、不加無機鹽、pH 5.4，溫度28℃，其中影響抑菌物質產生的較大因素是碳源和溫度。這一結果為B7細菌的實際開發利用奠定了基礎。