一種植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其金柑上的瞬時表達(dá)

摘要：以植物表達(dá)載體pCambial301的帶內(nèi)含子的GUS(iGUS)基因替換植物表達(dá)載體pBI121中的GUS基因，構(gòu)建了以pBI121為基礎(chǔ)載體并含有iGUS的植物表達(dá)載體pLZ13。農(nóng)桿菌染色表明，pCamiba1301和pLZ13兩載體中的iGUS基因均不會導(dǎo)致GUS染色反應(yīng)。以金柑不同組織為材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)開展瞬時表達(dá)研究，結(jié)果表明，pLZ13和pCambial301兩載體的iGUS在CaMV 35S啟動子調(diào)控下的表達(dá)沒有差異，證明構(gòu)建的pLZ13是一種同時適于瞬時表達(dá)和轉(zhuǎn)基因研究的植物表達(dá)載體。

關(guān)鍵詞：金柑；iGUS；瞬時表達(dá)；啟動子；轉(zhuǎn)基因；植物表達(dá)載體

中圖分類號：S666.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-9980(2008)03-431-04

基因工程技術(shù)是植物遺傳改良的重要手段之一，植物組織或發(fā)育階段特異啟動子的篩選和鑒定是植物基因工程研究的重要內(nèi)容。在啟動子下游融合一個報(bào)告基因，依據(jù)報(bào)告基因在不同時空或者處理后的表達(dá)可研究啟動子的功能。在這些研究中，穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)基因)和瞬時表達(dá)手段常被使用。

由于瞬時表達(dá)手段快速且簡單，且不受遺傳轉(zhuǎn)化難易的影響，廣泛應(yīng)用于特異啟動子的初步篩選和鑒定，特別是果實(shí)特異啟動子的研究。內(nèi)含子作為真核與原核生物功能基因的重要差異，在真核生物mRNA成熟過程中可被精確地切除，而在原核細(xì)胞中則不會，故帶內(nèi)含子的GUS基因(iGUS)更適于瞬時表達(dá)研究。

pBI121和pCambia1301是最常用的植物表達(dá)載體之一。不少轉(zhuǎn)基因研究所用的表達(dá)載體以其為骨架改造而成。pBll21含有GUS基因，不適于瞬時表達(dá)研究；而pCambial301因?yàn)椴捎贸泵顾睾Y選體系而在柑橘轉(zhuǎn)基因研究中極少應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因和瞬時表達(dá)手段是鑒定啟動子特性的2種有效手段，結(jié)合使用最有說服力。基于pBI121和pCambia1301的植物表達(dá)載體的各自優(yōu)缺點(diǎn)，對于每個待研究的啟動子，需要分別構(gòu)建基于pBI121和pCambia1301的植物表達(dá)載體，這不但增大了工作量，且由于應(yīng)用了不同載體不利于結(jié)果的相互印證。另外，pCambia1301載體的啟動子兩側(cè)缺乏常用內(nèi)切酶位點(diǎn)，對更換啟動子帶來很大不便。因此，作者旨在從載體pCam—bial301中酶切獲得iGUS基因，然后替換pBI121中的GUS基因。獲得一個既適于轉(zhuǎn)基因也可用于瞬時表達(dá)研究的植物表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證。

1 材料和方法

1．1 材料

以金柑(Fortunella crassifolia Swingle)組培苗的根、莖、葉，金柑成年樹的花瓣、子房、果實(shí)為實(shí)驗(yàn)試材。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tttmefaciens)菌株GV3101，植物表達(dá)載體pBI121和pCmabia1301質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存。試驗(yàn)所用的限制性內(nèi)切酶BstEⅡ，Nco Ⅰ，Not Ⅰ，Sac Ⅰ，Xba Ⅰ購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1．2 方法

2．2 含不同表達(dá)載體的農(nóng)桿菌GUS染色結(jié)果

含不同表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液經(jīng)GUS組織化學(xué)染色。不含表達(dá)載體以及含有pLZ13或pCamibial301(均攜帶iGUS基因)的農(nóng)桿菌GV3101染色結(jié)果均顯示無色，而包含pBll21(攜帶無內(nèi)含子的GUS基因)的農(nóng)桿菌被染成藍(lán)色(圖版－a～d)。

2．3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達(dá)GUS染色結(jié)果

分別以含有pLZl3及pCambia1301表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化金柑不同組織器官做瞬時表達(dá)研究(圖版-A1～F2)。2個載體中的具內(nèi)含子GUS基因在組成型CaMV 35S啟動子調(diào)控下，在金柑各個組織中均表達(dá)。其中根、花瓣、果實(shí)組織有明顯藍(lán)色斑塊或斑點(diǎn)，莖段在橫切面上藍(lán)色較為明顯。葉片和子房中藍(lán)色斑點(diǎn)較少且較淡。表明pLZ13載體中的iGUS基因與pCambia1301中的該基因功能相同，因而pLZl3適于瞬時表達(dá)研究。

3 討論

啟動子作為轉(zhuǎn)錄水平上一種重要的調(diào)控元件，在基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。近年來，研究特異啟動子功能及其調(diào)控因素已成為基因工程技術(shù)的重要內(nèi)容。不含內(nèi)含子的GUS基因在農(nóng)桿菌中可以正常表達(dá)，因此，在瞬時表達(dá)研究中可造成嚴(yán)重干擾，影響表達(dá)強(qiáng)度的準(zhǔn)確檢測。如GUS染色結(jié)果表明。pBI121載體中不含內(nèi)含子的GUS基因在農(nóng)桿菌中可以得到表達(dá)。因此，若將pBI121載體用于瞬時表達(dá)。將難以區(qū)分染色結(jié)果是由于農(nóng)桿菌污染造成還是GUS基因在植物組織中的瞬時表達(dá)所致。同時，在穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因研究中，在初期檢測時由于存在農(nóng)桿菌污染也使檢測受到干擾。

為避免這一干擾，采用iGUS基因作為瞬時表達(dá)載體的報(bào)告基因已逐漸成為趨勢。由于原核細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄過程中沒有剪接內(nèi)含子的能力，因而含有內(nèi)含子的基因只能在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)而不能在原核細(xì)胞中表達(dá)。對pCambia1301和pLZ13(均含有iGUS基因)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌進(jìn)行GUS染色所得的結(jié)果也證實(shí)這一策略的可行性(圖3)。

pBI121和pCambia1301是最常用的2種植物表達(dá)載體之一，但前者不適于瞬時表達(dá)(GUS基因在農(nóng)桿菌中可表達(dá))而后者不適于柑橘轉(zhuǎn)基因(采用潮霉素篩選，柑橘上此篩選體系尚不成熟)。因此，本研究用pCambia1301中的iGUS基因替代pBI121中的GUS基因，獲得了一個兼具pCambia1301含農(nóng)桿菌中不表達(dá)的iGUS以及pBOI121具有常用酶切位點(diǎn)及卡那抗性基因優(yōu)點(diǎn)的植物表達(dá)載體pLZ13。該載體是一種既適于瞬時表達(dá)也可用于轉(zhuǎn)基因研究的植物表達(dá)載體。在后續(xù)研究中，我們分離了番茄果實(shí)特異啟動子2A11，并用其代替了pLZ13表達(dá)載體中的CaMV 35S啟動子，應(yīng)用本文建立的瞬時表達(dá)體系和先前建立的轉(zhuǎn)基因體系對2A11啟動子在金柑中的表達(dá)特性進(jìn)行了探討。