膠原蛋白的性質分析

［收稿日期］2008年6月18日

［作者簡介］李海青：長春師范學院生物科學專業(yè)。

［摘 要］膠原蛋白被稱為“骨中之骨，膚中之膚”，可以說是真皮層強有力的后盾，其對皮膚的作用不言而喻。膠原蛋白是一種生物性高分子物質，在動物細胞中扮演結合組織的角色。為生物科技產業(yè)最具關鍵性的原材料之一，也是需求量十分龐大的最佳生醫(yī)材料。其應用領域包括生醫(yī)材料、化妝品、食品工業(yè)、研究用途等。

［關鍵詞］膠原蛋白 羥脯氨酸 比色法

［中圖分類號］Q

［文獻標識碼］A

［文章編號］1009－5489(2008)07－0192－02

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膠原蛋白(collagen)是一種高分子蛋白質，絲狀的膠原蛋白纖維能使皮膚保持結實而有彈性。它存在于人體皮膚、骨骼、牙齒、肌腱等部位，主要生理機能是做結締組織的粘合物質。在皮膚方面，它與彈力纖維合力構成網狀支撐體，提供真皮層安定有力的支撐。隨著年齡的增長，人體膠原蛋白含量會逐漸流失，網狀支撐體亦會漸漸變厚變硬、失去彈性，當真皮層的彈性與保水度降低，皮膚便會失去彈性并變薄老化，同時可導致真皮的纖維斷裂、脂肪萎縮、汗腺及皮脂腺分泌減少，使皮膚出現(xiàn)色斑、皺紋等一系列老化現(xiàn)象，顯出老態(tài)。

膠原蛋白是人體皮膚的主要成分，占皮膚干重70%-80%。醫(yī)學研究提示；膠原蛋白中的羥脯氨酸是人體皮膚形成的關鍵物質。“膠原蛋白在結締組織與彈性蛋白及多糖蛋白相互交織形成的網狀結構，產生一定的機械強度，是承托人體曲線，體現(xiàn)挺拔體態(tài)的物質基礎。膠原蛋白還能保持血管壁彈性，防止血管破裂，栓塞。提高關節(jié)、軟骨以及韌帶的潤滑，減輕關節(jié)僵硬、酸痛、積水等癥狀。

現(xiàn)知膠原蛋白可依據分子結構和生物學功能的差異區(qū)分為十三種不同類型，其中較主要的有：Ⅰ型，主要存在于成人皮膚和骨組織；Ⅱ型，主要存在于軟骨組織；Ⅲ型，主要存在于嬰幼兒皮膚或血管內膜；Ⅳ型，主要存在于各組織器官的基底膜。與皮膚生理功能密切相關的主要為Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白。

一、材料與方法

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1.材料

選用經檢疫合格的魚鱗，清洗干凈，去除殘留脂肪組織，切成小顆粒或細條狀，于－18℃凍藏備用。

2.儀器

電子天平，WZF—2102PC紫外可見分光光度計，HHS—2型電熱恒溫水浴鍋等。

3.試劑

羥脯氨酸，氯胺T，檸檬酸，氫氧化鈉，醋酸鈉，正丙醇，對二甲氨基苯甲高氯酸，異丙醇，硫酸等試劑，均為分析純。

4.實驗方法

(1)試劑配制

①pH6.8的檸檬酸緩沖溶液：溶解26.0g檸檬酸C₆H₈O₇

，H₂

O，14.0g氫氧化鈉和78.0g醋酸鈉于約500ml水中，轉移溶液到1000ml容量瓶中。加入250ml正丙醇，用水稀釋至刻度。此液于4℃在深色瓶中保存，可穩(wěn)定幾個星期。

②氯胺T試劑：溶解1.41g氯胺T于100ml如上的緩沖試劑中(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

③對二甲氨基苯甲醛試劑：稱取10.0g對二甲氨基苯甲醛，溶解于35.0ml高氯酸［60%(m/m)］，緩慢加入65.0ml異丙醇(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

④羥脯氨酸標準儲備液，500ug/ml：準確稱取羥脯氨酸標準品50.0mg，用少量水溶解于100ml容量瓶中，加入一滴3mol/L硫酸，定容至刻度。該溶液在4℃下能穩(wěn)定至少一個月。

⑤羥脯氨酸標準工作液：吸取5ml羥脯氨酸標準儲備液丁500ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容(臨用前配)，質量濃度為5ug/ml。

(2)羥脯氨酸標準曲線的繪制

參照IS03496(E)法［5］，繪制羥脯氨酸標準曲線。

準確吸取羥脯氨酸標準工作液10.0、20.0、30.0與40.0ml，分別用蒸餾水定容至100ml，此標準溶液的羥脯氨酸濃度分別為0.5、1.0、1.5和2.0ug/ml。

吸取4ml上述稀釋好的溶液于具塞試管中，加入2.00ml氯胺T，搖勻后在室溫下放置20min，加入2.00ml顯色劑，搖勻后迅速將試管移至60℃的水浴鍋中，保溫20min，再用流動的自來水冷卻試管至少3min，室溫下放置30min，最后用紫外可見分光光度計在558±2nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線，建立線性回歸方程。空白溶液用蒸餾水代替，過程同上。

(3)樣品處理與羥脯氨酸的測定

稱取魚鱗原料4g左右于錐形瓶中，于105℃硫酸溶液中水解16h，過濾到250ml的容量瓶中，定容至刻度。稀釋該溶液中的羥脯氨酸濃度至0.5～2.0μg/ml，再經氯胺T氧化，最后根據氧化后的羥脯氨酸與對二甲氨基苯甲醛反應生成的紅色化合物，在波長558nm±2nm處比色。樣品中羥脯氨酸含量按公式(1)計算：

w=(C×4×F×10－3)/M(公式1)

式中：w——提取山的羥脯氨酸含量，mg/g；

c——標準曲線上相應的羥脯氨酸濃度，μg/ml；

M——稱取樣品質量，g；

F——稀釋倍數(shù)。

(4)回收率測定

分別稱取4g左右魚鱗，各加入40mg和120mg標準羥脯氨酸，按上述樣品前處理步驟進行實驗，測定羥脯氨酸含量，按(公式2)計算回收率。每一樣品做3次平行試驗，并對結果進行誤差分析。

回收率(%)=(X－Y)×100/Z(公式2)

式中：X——加入羥脯氨酸后樣品中羥脯氨酸的測定總量，mg；

Y——樣品中羥脯氨酸測定量，mg；

Z——加入標準羥脯氨酸量，mg。

二、結果與討論

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1. 羥脯氨酸標準曲線的繪制

按照“(2)”的方法進行測定，羥脯氨酸標準樣品濃度與吸光度的測定結果如表1表示。

以羥脯氨酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，計算其回歸方程為：y=0.2333x+0.0016，相關系數(shù)R2=0.9999，因此，吸光度和羥脯氨酸濃度之間有很好的相關性。

2.魚鱗中羥脯氨酸含量的測定

將原料魚鱗的水解液，按“(3)”的方法處理后，測定吸光度并計算Hyp濃度，結果見表2。

由表2可知，魚鱗中羥脯氨酸含量的平均值為23.18mg/g。由于羥脯氨酸濃度和膠原蛋白濃度早正相關，羥脯氨酸濃度的變化即可反映魚鱗中膠原蛋白的變化。

3.回收率的測定

取6個樣品，按“(4)”的方法分別測定，計算同收率，結果如表3所示。

由表3數(shù)據可看出，樣品同收率在84.20%～89.10%之間，平均回收率為85.97%，可滿足分析研究的需要，對魚鱗膠原蛋白的提取有很好的適用性。

三、結語

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采用分光光度計測定魚鱗中羥脯氨酸的質量濃度有較好的回收率，可以用來分析豬皮膠原蛋白提取過程中的變化情況。魚鱗膠原蛋白的功能性除與膠原蛋白的含量有關外，還與膠原蛋白的相對分子質量、膠原蛋白中的金屬離子等有關，這需要借助其他方法進一步加以研究。隨著現(xiàn)今科技的發(fā)展、研究的深入，人們已逐漸發(fā)現(xiàn)豬皮是一種很好的膠原蛋白源。隨著人們崇尚“綠色”、回歸自然意識的日益增強，以膠原蛋白為原料和添加劑的化妝品。膠原蛋白之所以在美容護膚領域有著無可取代的地位，是因為其本身是一種由三股螺旋形纖維所構成的透明狀物質，這種比dna分子的“雙螺旋”結構更為神奇的“三螺旋”結構能夠強勁地鎖住水分子。另外，膠原蛋白中還含有大量的氨基酸，它們都是天然保濕因子成分，其中一種獨特的氨基酸——羥脯胺酸，被證明是純品膠原蛋白確保皮膚新生的膠原合成的最佳途徑。

［參考文獻］

［1］沈同、王鏡巖：《生物化學》(上冊)，高等教育出版社1980年版。

［2］http：//zhidao.baidu.com/question/34825302.html

［3］http：//baike.baidu.com/view/67544.htm

［4］張俊杰、曾慶孝：《淮海工學院學報》(自然科學版)2004年第1期。