比濁法測定硫酸抗敵素效價

摘 要 目的：建立比濁法測定硫酸抗敵素效價的方法。 方法：確定比濁法測定硫酸抗敵素的線性范圍，在線性范圍內選擇高、低劑量對硫酸抗敵素進行效價測定，并與管碟法效價測定結果進行比較。結果與結論：比濁法與管碟法測定結果無明顯差異，比濁法測定硫酸抗敵素效價具有精確、便捷等特點，可用于產品質量控制。

關鍵詞 效價 比濁法 管碟法 硫酸抗敵素

中圖分類號：R917 文獻標識碼：B 文章編號：1006-1533(2008)11-0519-03

Turbidimetric method in the determination of titer of colistin sulfate

Bian Jinni， Cao Qiong， Li Ping

(Shanghai Xinxianfeng Pharmaceutical Co， Shanghai，201203)

ABSTRACT Objective:

To establish turbidimetric method to determine the titer of colistin sulfate. Methods: The linear range of colistin sulfate by turbidimetric method was measured and the titer of colistin sulfate at high and low dose in the linear range was tested andthe testing results were compared with those of diffusion method. Results and Conclusion: There was no significant difference between turbidimetric and diffusion method. Turbidimetric method can be used for quality control for its accuracy and convenience.

KEY WORDS turbidimetric method; diffusion method; colistin sulfate

國際上一般采用比濁法和管碟法并行的方法來進行微生物效價測定。兩者都是通過比較標準品與供試品的抑菌能力來測定藥物的抗菌能力。比濁法是《中華人民共和國藥典(2005年版)》的新增項目。與管碟法相比較，雖然比濁法在檢驗品種上受到一定的限制，但其具有較高精確性和重現性，并且操作簡便，可明顯縮短實驗時間。尤其對中間產品的檢驗具有重要意義。本文建立了比濁法測定硫酸抗敵素效價的方法，并與管碟法進行比較。

1 材料與方法

1.1 儀器

722光柵分光光度計（上海第三分析儀器廠）；CP225D電子天平（Sartoris公司）；HHS-21-6恒溫水浴鍋（上海豫康科教儀器設備有限公司），HHBII-600恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）。

1.2 培養基與試劑

抗生素檢定培養基III（北京三藥科技開發公司，批號：070122）；磷酸氫二鉀（廣東光華化學廠，批號：20050321）；磷酸二氫鉀（廣東光華化學廠，批號：20031007）；營養瓊脂斜面培養基（北京三藥科技開發公司，批號：070409）；12%甲醛（上海凌峰化學試劑有限公司 ，批號：071030）。

1.3 菌株

大腸桿菌(E. coli 44103)（中國藥品生物制品檢定所）。

1.4 標準品與對照品

硫酸抗敵素標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：130327-200305，效價：22 106 u/mL）；硫酸抗敵素原料藥

（上海新先鋒藥業有限公司，批號：2004-06-06，效價：19 783 u/mL；上海新先鋒藥業有限公司，批號：2004-06-07，效價：20 356 u/mL）；

注射用硫酸抗敵素（上海新先鋒藥業有限公司，批號：060505，效價：19 877 u/mL；上海新先鋒藥業有限公司，批號：060506，效價：19 482 u/mL）。

2 方法

2.1 檢定培養基的制備

稱取抗生素檢定培養基III 19 g，加入1 000 mL水，加熱煮沸至完全溶解，過濾，調節pH至7.0～7.2，115℃滅菌30 min后備用。

2.2 pH 6.0磷酸緩沖液的制備

稱取2.6 g磷酸氫二鉀與8 g磷酸二氫鉀，加入1 000 mL水，溶解后115℃滅菌30 min后備用。

2.3 含菌培養基的制備

取大腸桿菌培養物，接種于營養瓊脂斜面培養基上，置于36℃恒溫培養箱中培養24 h后，用10 mL滅菌水洗下菌苔，置于試管中，加入適量滅菌水稀釋，使其在650 nm波長處的吸光度為1.0［1］。取0.7 mL菌懸液加入100 mL抗生素培養基III中，充分混勻后備用［2］。

2.4 比濁法線性范圍的測定

根據標準［3］設計線性實驗，以20 u/mL作為中心濃度，劑間比為1.25，線性實驗劑量依次為：12.8 u/mL、16 u/mL、20 u/mL、25 u/mL、31.3 u/mL。

稱取適量硫酸抗敵素標準品，用pH 6.0磷酸緩沖液溶解并稀釋至1 000 u/mL［4］，分別取適量該標準品溶液，用pH 6.0磷酸緩沖液稀釋至12.8 u/mL、16 u/mL、20 u/mL、25 u/mL、31.3 u/mL。分別取上述標準品溶液1 mL置于滅菌后的試管中（每個濃度5管），于每管中加入9 mL含0.7 %菌懸液的培養基，立即搖勻，放入36℃恒溫水浴中培養4 h［1，6］。另取一支試管加入10 mL含0.7 %菌懸液的培養基與0.5 mL的12 %甲醛，放入冰箱，作為空白對照。將試管取出后，立即放入冰水浴中，加入0.5 mL的12%甲醛［5］，于530 nm波長處測量其吸光度。

2.5 效價測定

根據線性范圍實驗結果設計實驗。低劑量為13 u/mL，高劑量為26 u/mL，劑間比為2∶1。

分別稱取適量硫酸抗敵素標準品與供試品，用pH 6.0磷酸緩沖液溶解并稀釋至1 000 u/mL［4］，分別取適量該標準品溶液與供試品溶液，用pH 6.0磷酸緩沖液稀釋至13 u/mL、26 u/mL。分別量取上述標準品溶液1 mL置于試管中（每個濃度5管），于每管中加入9 mL培養基菌液，立即搖勻，放入36℃恒溫水浴中培養4 h［3］。另取一支試管加入10 mL含0.7 %菌液的培養基與0.5 mL的12 %甲醛，放入冰箱，作為空白對照。將試管取出后，立即放入冰水浴中，加入0.5 mL的12 %甲醛，于530 nm波長處測量其吸光度，根據《中華人民共和國藥典(2005年版)》方法計算結果。

3 結果

3.1比濁法線性范圍

根據2.4項中方法確定比濁法的線性范圍，以劑量濃度的對數值為橫坐標，吸光度為縱坐標，如圖1所示。



劑量濃度的對數值與OD530的線性關系可采用方程：y =﹣0.185x﹢0.680 5，R2 = 0.990 2描述。結果表明，在12.8 u/mL～31.3 u/mL范圍內劑量濃度對數值與吸光度線性關系良好，因此可進一步在該范圍內選擇比濁法效價測定的高、低劑量。

3.2 效價測定

根據2.5項中方法對硫酸抗敵素的效價進行測定，比濁法效價測定結果與管碟法效價測定結果進行比較，結果如表1。

2批數據結果相似，因此采用1批數據作為結果統計。 由以上結果可以得出：管碟法與比濁法效價測定結果并無較大差異，比濁法可信限優于管碟法。 

3.3 重現性測定和回收率實驗

通過計算每批樣品效價測定結果的相對標準偏差RSD，對比濁法與管碟法的重現性進行分析。表2所示的RSD分析表明，比濁法重現性較好。

為了進一步比較比濁法和管碟法的測定效果，對兩種方法的回收率進行比較(見表3)。結果表明比濁法具有較好的回收率。

4 討論

4.1 高、低劑量的確定

在實驗過程中發現，通常高劑量的吸光值測定結果比低劑量的吸光值測定結果穩定。這是由于實驗中藥品濃度較低，從而使稀釋過程中的誤差對實驗結果造成了一定的影響。藥品濃度越低，誤差對實驗結果影響越大。因此在選擇高、低劑量濃度時，應盡量在線性范圍內選擇較高濃度進行效價測定。本實驗中選擇低劑量為13 u/mL、高劑量為26 u/mL，劑間距為2∶1，符合《中華人民共和國藥典(2005年版)》規定。

4.2 比濁法與管碟法對比

從表1的實驗結果可以看出，比濁法與管碟法的測定結果并無明顯差異。但比濁法可信限明顯優于管碟法。在實驗過程中發現，管碟法有時會出現抑菌圈邊緣不清晰、測量結果不穩定等情況。在比濁法法實驗過程中，瓊脂中含有的雜質往往影響了藥品擴散速度從而導致實驗結果不穩定，同時手工滴加藥品也會使抑菌圈測量結果產生一定的誤差。而比濁法采用儀器測定，具有較高的精密度和靈敏度，因此其實驗結果則相對較穩定。同時，RSD與回收率的分析結果也表明了比濁法具有較高的準確性與重現性。

4.3 影響比濁法實驗準確性的因素

在比濁法效價測定實驗過程中必須注意以下細節，以保證實驗準確性：實驗用菌液必須在實驗當天制備完成，在培養前應搖勻試管，使菌液與藥品均勻分布于試管中，以免造成實驗數據混亂；實驗中所用的培養基必須色澤澄清，培養基中含有的雜質會影響實驗的準確性，因此培養基必須經過濾、滅菌后方可使用；在培養結束后，應立即將試管放入冰水浴中，使試驗菌同時停止生長，然后再加入12 %甲醛溶液，以避免由于試驗菌停止生長不同步而產生的誤差；實驗中應選擇大小、厚度均一的試管，使各個試管中的培養物均衡受熱，減小實驗誤差。

參考文獻

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2 趙曉冬，張亞杰，傅蓉，等. 微生物比濁法與管碟法測定磷霉素鈉效價的評價［J］. 實用物與臨床，2006，9(2)：75.

3 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典二部［M］.2005年版.北京：化學工業出版社，2005：附錄81-83.

4 文曉玲，劉興蘭，任璽如. 比濁法測定阿奇霉素效價［J］. 中國藥事，2005，19(6)：349.

5 李哲媛，康勇，范兵. 微生物比濁法測定硫酸慶大霉素注射液的效價［J］. 藥物鑒定，2005，14(3)：38 .

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(收稿日期：2008-02-21)