角質形成細胞生長因子的研究進展

郝曉艷　郭樹忠

角質形成細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)是由間質細胞分泌的，通過旁分泌途徑刺激上皮增殖的細胞因子。研究表明KGF在組織修復過程中發揮著很重要的作用，這些作用主要是KGF通過加強上皮屏障功能完成，包括促進細胞的增殖、遷移、分化、存活等。重組人角質形成細胞生長因子Palifermin已由FDA批準用于治療放化療導致的嚴重口腔粘膜炎。本文將對KGF的生物學特性、表達調控、生物學功能、及重組KGF的研究和應用進行討論。

1KGF的生物學特性

角質形成細胞生長因子（KGF）是1989 年由Rubin 等[1]首先從人胚胎肺成纖維細胞的生長培養液中分離出來的單鏈多肽，分子量為26～28 kDa。KGF 的cDNA 編碼194個氨基酸，包含一分泌所需的信號肽和N端的糖基化位點。重組人KGF（recombinant human KGF,rhKGF）在細菌中表達時，產生分子量21kDa的活性蛋白，rhKGF與天然的KGF分子量的差異主要是因為哺乳動物中表達的KGF進行了糖基化修飾，但這種翻譯后的修飾對于其生物活性不是必需的，而且rhKGF的活性約是從成纖維細胞培養液中分離得到的天然KGF的10倍。基因序列分析表明KGF從屬于成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)家族,也稱FGF7。KGF與FGF1、FGF2相比，同源序列大約位于KGF編碼區羧基端的2/3處。在這個同源序列區，KGF與其它成纖維細胞生長因子家族成員約有30%～45%的同源性。除人胚胎肺成纖維細胞表達KGF外，很多組織的間質細胞都可表達KGF，比如成年人的肺、皮膚、乳腺、胃、膀胱及前列腺等。最先一直認為上皮細胞不表達KGF,后來的一些實驗證實KGF除主要表達于間質細胞外，一些上皮細胞也可表達KGF,如豬子宮內膜上皮、培養的牛卵巢上皮、及晶狀體上皮細胞。此外皮膚、胃腸道、陰道內活化的細胞也可表達KGF，而內皮內或淋巴結內的細胞和細胞均檢測不到KGF的表達，而從胸腺分離的T細胞可表達KGF，CD3-、CD4－、CD8－的胸腺細胞未檢測出表達KGF，但CD4+、CD8+的胸腺細胞可表達KGF[2]。血管平滑肌細胞如猴子宮螺旋動脈平滑肌細胞、培養的人隱靜脈、髂動脈平滑肌細胞也可表達有活性的KGF。KGF在黑色素細胞和黑色素瘤細胞內也可表達。KGF可作用于鼠上皮細胞、人乳腺上皮細胞、猴氣管上皮細胞、人角質細胞、鼠和人前列腺上皮細胞、鼠肝細胞、2型肺泡細胞、角膜上皮細胞和牛卵巢顆粒細胞。KFG對成纖維細胞、靜脈內皮細胞，黑色素細胞沒有作用。一直以來認為KGF與其他FGF不同的是KGF的靶細胞僅為上皮細胞，但后來發現也可促進角膜及小血管內皮細胞的增殖，而在這些細胞不能檢測到其特異性受體FGF2b的表達，所以KGF是否是通過其他高親和受體作用于血管內皮，還有待進一步研究。

2KGF表達的調控

巨噬細胞和多形核粒細胞分泌大量的致炎因子IL-1和IL-6，IL-1和IL-6能促進成纖維細胞內KGF基因的轉錄和蛋白的合成。角質細胞本身分泌IL-1通過c-Jun和c-JunB轉錄因子刺激成纖維細胞表達KGF和GM-CSF，然后KGF和GM-CSF通過旁分泌的方式刺激角質細胞增值和分化[3]。角質細胞分泌的甲狀旁腺激素相關蛋白也可刺激成纖維細胞表達KGF，然后KGF又通過旁分泌的方式促進角質細胞的增殖和分化。局部出血導致血小板浸潤，釋放一系列生長因子，包括血小板源衍生生長因子(PDGF)和表皮生長因子，后者又刺激成纖維細胞表達KGF，通過KGF脂質體轉染鼠急性傷口發現PDGF表達水平與對照組相比沒有變化，這也進一步證實了PDGF在組織損傷修復過程中位于KGF信號的上游[4]。此外TNF- 也可刺激成纖維細胞表達KGF。性甾體類激素可通過作用于間質細胞，使KGF的表達量上調來影響精囊、前列腺、子宮內膜的上皮，雄激素刺激成年鼠前列腺的間質細胞表達KGF，也可刺激正常人前列腺間質細胞表達FGF-10，黃體酮和雌激素也能使KGF表達上調。糖皮質激素對KGF的表達起負性調節作用，地塞米松可減少KGF基因的轉錄以及減弱KGF轉錄產物的穩定性。

3KGF的生物學功能

KGF表達量上調見于鼠和人全層皮膚損傷、膀胱手術損傷、化療藥物導致的肝損傷、新生兔缺氧性肺損傷、博來霉素導致的急性肺損傷，人炎癥性腸病以及銀屑病。而在所有這些疾病中，上皮細胞均表達了KGF的特異性受體FGFR2b，這就提示KGF參與了各種上皮的保護和修復過程。KGF脂質體轉染鼠急性傷口后再上皮化加速、胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、KGF、FGF、VEGF和Ⅳ型膠原表達增加。Jeschke等[5]也證實了這一結果，并且發現IGF-1和KGFcDNA共轉染后VEGF表達量高于單一轉染，血管新生作用也可增強。KGF脂質體轉染后PDGF的表達無差異，而 轉化生長因子的表達減少( GF-)，已知PDGF與傷口周圍早期炎癥反應有關，TGF- 可促進Ⅰ型膠原的合成，從而導致瘢痕的發生。所以KGFcDNA治療促進再上皮化但同時即不加重炎癥反應也不促進瘢痕形成。

促有絲分裂作用：KGF可促進細胞DNA的合成，如人和鼠角質細胞、猴支氣管上皮細胞、人和鼠前列腺上皮細胞，鼠肝細胞、Ⅱ型肺泡細胞、角膜上皮細胞和牛卵巢顆粒細胞。已經發現一些基因與KGF的促有絲分裂作用相關，如c-myc、c-fos，這二者是多種細胞分化所必需的最初應答基因。除此之外，還發現一些調控核酸合成的關鍵酶的基因，如腺苷酸琥珀酸裂解酶，以及嘌呤從頭合成和旁路合成的相關酶，添加KGF后，這些酶在HaCaT角質細胞的表達上調，提示KGF與核酸的合成有關，為DNA的復制和RNA的合成提供足夠原料。另一個通過RT-PCR發現與KGF促進DNA合成有關的基因是與酵母同源的CHL-1基因，這個基因編碼能使染色體分離的解螺旋酶。而且KGF 可誘導角質細胞表達 轉化生長因子(TGF-，后者是另一種上皮促有絲分裂源，這就放大了KGF促上皮細胞的有絲分裂作用。

促進細胞遷移作用：KGF可通過劑量依賴性促進正常人角質細胞的遷移，該作用可被KGF中和抗體抑制。KGF作用于角質細胞使得角質細胞對膠原和纖維連接蛋白的粘附能力增強，這便有利于角質細胞在這些基質上的遷移。KGF在體外實驗中也可誘導Ⅱ型肺泡細胞的遷移。在再上皮化過程中，角質細胞先脫離基底膜然后開始遷移，再上皮化過程還需降解傷口周圍的凝血塊、真皮及肉芽組織。多種基質金屬蛋白酶(MMP)參與了這一過程。KGF可促進角質細胞合成MMP-1，KGF也可直接誘導MMP-9、MMP-10、MMP-13以及尿激酶型纖維蛋白溶解酶原激活質。這些提示KGF調控著傷口愈合組織重塑過程中酶的表達[6]。

調控細胞分化作用：KGF通過誘導角質細胞終末分化的標記分子來促進角質細胞的分化，如誘導整合素的表達，延遲角蛋白和轉谷氨酰胺酶的表達。GF也可影響肺上皮細胞的分化，在肺受到損傷后，Ⅱ型肺泡細胞分化成Ⅰ型肺泡細胞參與氣體交換。Ⅱ型肺泡細胞與KGF一同培養時，可長時間保持Ⅱ型肺泡細胞的形態，誘導成Ⅰ型肺泡細胞的時間也延長，Qiao等[7]進一步發現KGF通過激活c-Jun轉錄因子來維持Ⅱ型肺泡細胞形態。重組KGF可誘導胃腸道內分泌粘蛋白的杯狀細胞的分化。KGF也可促進胰腺外分泌細胞分化成導管上皮細胞。

3.4 抗調亡作用：KGF可使放線菌D和腫瘤壞死因子TNF誘導的肝細胞凋亡減少。在全腸外營養的小鼠模型，胃腸道上皮細胞發生嚴重凋亡，給予KGF后可減少細胞凋亡以及增加抗凋亡蛋白Bal-2的表達[8]。在肺，KGF不僅刺激Ⅱ型肺泡細胞增殖，同時維持其形態，防止其凋亡以及分化成Ⅰ型肺泡細胞。KGF也可抑制缺氧誘導的肺上皮細胞發生凋亡，可能是通過抑制凋亡介導分子的表達，如p53、p21、Bax和Bcl-x。上文提到黃體酮可刺激KGF的表達，Slayden等[9]發現外源的KGF可抑制黃體期基底層細胞的凋亡，這對螺旋動脈的營養供給起重要影響。

3.5細胞保護作用：損傷使得KGF大量表達，并參與損傷組織的修復過程。而且KGF對外源致傷因子可能造成的細胞損傷具有防護作用。外源KGF可減輕高氧造成的肺損傷。氧化應激最早效應是細胞DNA鏈的斷裂，這將導致細胞發生凋亡或壞死。體外實驗證實KGF可減少高氧導致的A549肺泡上皮細胞DNA鏈的斷裂。KGF也可防止體內缺氧誘導的肺上皮細胞死亡，它通過激活抗凋亡S6激酶、Akt信號旁路[10]。KGF可誘導角質形成細胞內Nrf-2轉化因子的表達，而后者調控多種酶的表達，而這些酶對活性氧(ROS)具有解毒功能,皮膚損傷后巨噬細胞和中性粒細胞表達ROS水平很高，主要是防御入侵的細菌，但是ROS也破壞臨近細胞。因此KGF有效的細胞保護作用是通過加強對活性氧的解毒功能而實現的[11]。此外KGF也可同UVB一樣通過激活KGFR并誘導角質形成細胞發生內化，從而介導黑色素顆粒從黑色素細胞轉移到角質形成細胞，保護皮膚免于UVB的損傷[12]。

4重組KGF(rKGF)的研究

重組人角質形成細胞生長因子Palifermin已由FDA批準用于治療放化療導致的嚴重口腔粘膜炎，這就需要大量具有生物活性的rhKGF，但是rhKGF在細菌內的產出率很低，有時甚至很難檢測到。研究者利用各種載體和宿主菌的多種不同的組合方式來表達KGF，以及嘗試KGF與谷胱甘肽(GST)融合表達，這雖然提高了KGF的表達量到3.2mg/L/OD600，但仍不及用同樣方法表達的FGF1、FGF2、FGF10的產量的1/10。后來研究者在培養基中加入10～100mM氯化鎂后，發現氯化鎂的用量在30mM時，GST-KGF融合蛋白在BL21(DE3)pLysS菌株的表達量最大，可達到17mg/L/OD600，而且氯化鎂的這種作用具有菌株特異性，氯化鎂不能提高在BL21(DE3)和DH5 菌株表達KGF的產量[13]。國內游力[14]等應用RT-PCR技術，擴增出KGFcDNA基因，在大腸桿菌表達系統中經IPTG誘導表達，重組蛋白約占菌體蛋白10％。

5臨床應用

重組人角質形成細胞生長因子(palifermin)2004年由美國FDA批準用于治療白血病患者高劑量化療或者聯合放療導致的嚴重口腔粘膜炎，商品名Kepivance。Palifermin為靜脈注射劑，在抗癌治療開始前后連續三天給藥，化療前后24h停藥，給藥劑量每天60mg/kg。Palifermin能減輕粘膜炎的嚴重程度和減少它的持續時間。Ellison等[15]通過實驗發現palifermin不光通過對上皮細胞的保護作用改善粘膜炎，而且可通過免疫調節作用來減少急性移植物抗宿主病的發生。

6總結與展望

KGF是一種多功能的生長因子，通過促進細胞的增殖、遷移、分化、存活、DNA修復以及誘導對活性氧具有解毒功能的酶的表達來加強上皮功能，從而保護上皮免于毒性物質的損傷。但KGF的生物學性質尚未全部了解，KGF主要通過與受體結合發揮生物學功能，但在有的病理生理過程中，KGF表達的上調并不伴隨其受體的表達上調，提示KGF是不是通過其它途徑發揮作用還有待進一步研究。Palifermin是首個應用的改善放化療導致的嚴重口腔粘膜炎的藥物，隨著KGF作用機制的研究進展，相信KGF的臨床應用范圍會更加廣泛。

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[收稿日期]2008-10-22[修回日期]2008-12-28

編輯/張惠娟