人羊膜對創(chuàng)面愈合的促進作用

梁　婧　范金財　蔡國斌

有效的創(chuàng)面覆蓋是創(chuàng)面愈合過程中的重要環(huán)節(jié)。創(chuàng)面覆蓋物種類繁多，可分為常規(guī)敷料、生物敷料和合成敷料等幾大類，具有保護創(chuàng)面、預防感染、防止體液和營養(yǎng)物質丟失、促進創(chuàng)面愈合等特點。羊膜作為生物敷料中較重要的一類，其應用最早始于1910年，Davis首先把胎膜（羊膜+絨毛膜）作為手術替代材料來進行皮膚移植取得成功。1913年Stem和Sabella分別報道了用羊膜來治療皮膚燒傷和皮膚潰瘍。此后羊膜被廣泛應用于各種手術：用于眼科，治療角膜缺損、結膜炎癥及缺損，效果良好[1-2]；用于燒傷等創(chuàng)面的覆蓋，具有誘導上皮再生、減少滲出物、減輕疼痛等功能；用于顱腦、腹腔和腰椎手術，可起到組織修補和預防粘連的作用。羊膜以其來源廣泛、取材方便、生物相容性好、抗原性低等優(yōu)點而被譽為“神奇之膜”。Ravishanker等[3]強調了在發(fā)展中國家醫(yī)院建立“羊膜庫”的重要作用。1998年在華沙建立了中央羊膜組織儲備庫。本文就有關羊膜的生物學特性、制備、貯存，對創(chuàng)面愈合的促進作用及其機制，以及羊膜的生物學改良等方面綜述如下。

1概述

1.1 羊膜的生物學特性：羊膜是從細胞滋養(yǎng)層衍化而來，位于胎兒絨毛膜的表面，為光滑、無血管、無神經(jīng)、無淋巴的雙層透明薄膜，厚約0.02～0.5mm，是人體中最厚的基底膜。由5層構成：①羊膜上皮：大部分為單層立方上皮，有合成、分泌和沉積基底膜和細胞外間質成分的能力；②基底膜：由狹窄的無細胞網(wǎng)狀纖維構成，厚度不一，含Ⅰ型膠原纖維網(wǎng)、層粘連蛋白和硫肝糖蛋白；③致密層：薄而致密，無細胞，由網(wǎng)狀纖維組成；④成纖維細胞層：是羊膜厚度的主要組成部分，由成纖維細胞和網(wǎng)狀纖維構成；⑤海綿層：由波浪狀網(wǎng)織纖維構成[4]。組織學及電鏡觀察，見羊膜內層是來自內胚層的上皮組織，包括數(shù)層鱗狀上皮細胞，但也可以見到成型的低立方形細胞；在近臍根部有時可見較厚的復層鱗狀上皮區(qū)，因而證實妊娠早期的羊膜具有與胎兒皮膚極相似的結構[5]，認為羊膜可能具有與皮膚相同的防御保護和屏障功能,在局部能起到保護創(chuàng)面不受細菌侵入,減少感染機會的作用。

1.2 羊膜的制備及貯存

1.2.1 羊膜的制備：嚴格按照供體醫(yī)學標準，無菌條件下取新分娩的健康剖宮產孕婦胎盤。產前母體行血清學檢查排除人體免疫缺陷病毒、乙肝病毒和丙肝病毒，排除巨細胞病毒和梅毒螺旋體等感染，孕婦產道無淋球菌或衣原體感染病史，無其他傳染性疾病和惡性腫瘤病史。將胎盤置于超凈工作臺中，用含抗菌藥物的PBS溶液反復沖洗以去除表面的凝血塊，然后鈍性分離將羊膜與絨毛膜組織分開，去除羊膜基底面殘留的絨毛膜和血管組織，生理鹽水反復沖洗后剪成所需大小方塊，浸泡于0.1%慶大霉素溶液或1∶1000新潔爾滅中15min后即可用于創(chuàng)面。

1.2.2 羊膜的貯存：自從Kim等首次應用4℃、體積分數(shù)100%的甘油保存的羊膜移植重建兔眼表獲得成功后，保存羊膜在臨床中的應用已非常廣泛。羊膜的貯存方法很多，大致有以下幾類：

1.2.2.1 DMEM/甘油深低溫保存法：將羊膜片放入裝有滅菌DMEM/甘油液（DMEM/甘油體積比為1∶1）的羊膜容器（經(jīng)高壓消毒的中性硅玻璃瓶），封閉瓶口置于-80℃冰箱保存。用前室溫自然解凍，并在生理鹽水中浸泡復水。

1.2.2.2 純甘油4℃保存法：將羊膜片放入裝有消毒純甘油的羊膜容器，24h后取出羊膜片，轉移到另一純甘油瓶中，封閉瓶口抽出殘留氣體后置于4℃冰箱中保存30天后使用。用前在生理鹽水中浸泡復水。

1.2.2.3 無水酒精保存法：將羊膜片放入裝有體積分數(shù)為75%酒精的羊膜容器中，24h后取出轉移到另一裝有體積分數(shù)100%酒精的容器中，4℃或室溫保存?zhèn)溆茫少A存半年，但要注意保持酒精濃度。用前在生理鹽水中浸泡復水。

1.2.2.4 真空干燥保存法：將羊膜片放入羊膜容器中，低溫真空干燥1h，加蓋蠟封后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｓ们霸谏睇}水中浸泡復水。

目前我國基層醫(yī)院應用最為廣泛的是純甘油4℃保存法，此方法簡便易行，經(jīng)濟安全，100%甘油作脫水和冷凍保護劑，可減輕冷凍對細胞的損傷，同時甘油對微生物還有殺滅作用；DMEM/甘油深低溫保存法因為需要采取深低溫冷凍設備，在我國應用較少，除了甘油的保護作用外，DMEM保存液中還含有供細胞生長的各種氨基酸、微量元素、各種維生素及緩沖系統(tǒng)的平衡液，且其Na+濃度與羊水較接近[6]；無水酒精保存法來源方便，可消毒防腐，但可使組織脫水、蛋白凝固變性，是無活性保存法；真空干燥保存法使蛋白質凝固變性，也是無活性保存，但此法不需要液體，攜帶方便。

1.3 羊膜的敷治方法

1.3.1創(chuàng)面處理：首先要處理創(chuàng)面，如潰瘍邊緣瘢痕增生明顯或有老化的肉芽組織應將其切除；創(chuàng)面肉芽水腫嚴重者，可采用3%～5%高滲鹽水濕敷，消除肉芽水腫；創(chuàng)面感染嚴重者，可根據(jù)創(chuàng)面的細菌培養(yǎng)結果，選用有效的抗生素濕敷；對于骨外露面積較大者，可行骨鉆孔或咬除部分骨皮質以利于肉芽生長。

1.3.2羊膜的貼敷：徹底清創(chuàng)后以75%酒精消毒周圍皮膚，1‰新潔爾滅消毒創(chuàng)面，按創(chuàng)面大小剪取羊膜。新鮮羊膜可直接貼敷，用酒精貯存的羊膜經(jīng)外用鹽水清洗后敷于創(chuàng)面，避免酒精對創(chuàng)面的刺激。羊膜應平整敷于創(chuàng)面，趕盡羊膜下氣體使羊膜與創(chuàng)面緊貼。羊膜邊緣應超出創(chuàng)緣約1cm。創(chuàng)面滲出較多時，可貼敷帶孔羊膜。羊膜貼敷后可暴露創(chuàng)面，也可以無菌敷料包扎。大部分創(chuàng)面在1～2天左右干燥結痂，可不必更換，直至創(chuàng)面愈合羊膜自行脫落。如膜下積膿，應及時清除后重新貼敷羊膜。羊膜干燥后注意觀察創(chuàng)面遠端的血液循環(huán)情況。

2羊膜對創(chuàng)面愈合的促進作用及作用機制

2.1 加快創(chuàng)面上皮化及愈合進程：動物實驗及臨床應用效果顯示，羊膜覆蓋創(chuàng)面后，上皮組織從創(chuàng)面周邊的皮緣向內爬行，創(chuàng)面肉芽組織生長明顯，生長速度明顯較對照組快。其原因可能與以下因素有關：①創(chuàng)面覆蓋羊膜后，膜下既沒有大量積液，減少了創(chuàng)面感染因素，又阻止了水分蒸發(fā)，保護了創(chuàng)面上殘留的上皮細胞，從而促進了創(chuàng)面的愈合[7]；②羊膜細胞內含有豐富的次級溶酶體，能使炎癥局部的肥大細胞分泌組胺潛在釋放因子，使局部血管擴張，改善局部的血流灌注，改善創(chuàng)面局部缺血狀況；③感染的控制和局部血液循環(huán)的改善為創(chuàng)面愈合提供有利條件；④羊膜含有纖維粘連素、層粘連素、Ⅳ型膠原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖，以及其他一些蛋白多糖大分子和一些細胞生長因子（Koizumi,NJ等研究發(fā)現(xiàn)，羊膜含有高水平的EGF、KGF、HGF和bFGF等多種生長因子）,有促進細胞黏附、遷移、增值和分化等重要功能，阻止上皮細胞凋亡；⑤另外，基底膜上的Ⅳ型膠原可延長接種其上的上皮細胞生長壽命，并保持其表型[8]。

2.2 減輕或消除創(chuàng)面疼痛：羊膜覆蓋創(chuàng)面后，具有明顯的疼痛減輕或消失作用。應用羊膜代替表皮，可起到物理屏障作用。貼敷創(chuàng)面后隔絕與外界的接觸，減輕創(chuàng)面淺表神經(jīng)暴露因冷熱或機械性刺激引起的疼痛，還可減少水分蒸發(fā)，防止創(chuàng)面枯干。此外如上文所述，羊膜細胞內含有豐富的次級溶酶體，能使炎癥局部的肥大細胞分泌組胺潛在釋放因子，通過使局部血管擴張改善局部的血流灌注，改善創(chuàng)面局部缺血狀況，避免創(chuàng)面組織壞死引起的疼痛。同時羊膜內含有活性成分如神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)遞質, 能營養(yǎng)神經(jīng)、促進神經(jīng)纖維再生。Mligiliche等[9]將羊膜細胞外基質制成管狀誘導周圍神經(jīng)再生，用以修復鼠坐骨神經(jīng)缺損，發(fā)現(xiàn)合適管徑的羊膜管能誘導坐骨神經(jīng)再生。張琪等[10]應用復合自體Schwann細胞的羊膜基底膜卷修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損，也證實了羊膜可以引導神經(jīng)再生和延伸。

2.3 保護創(chuàng)面，減少創(chuàng)面滲出：創(chuàng)面貼敷羊膜后，漿液性滲出減少，創(chuàng)面周圍水腫減輕或消失，原色澤蒼白的創(chuàng)面逐漸轉為紅潤，羊膜逐漸形成干燥的羊膜痂，患者略有緊繃感，創(chuàng)面愈合后痂皮自行脫落，表面完整。在整個創(chuàng)面愈合過程中，羊膜發(fā)揮著一個半透膜的作用，既避免了體液大量丟失，又有效防止了膜下積液形成，使創(chuàng)面保持一定濕度。這是以羊膜的結構特點為基礎的：電鏡下，見羊膜上皮細胞表面有許多微絨毛，基底部有細胞突起伸入基底膜形成足突樣結構。細胞突起與基底膜之間通過半橋粒結構形成緊密連接，微絨毛和橋粒連接共同在羊膜上皮細胞之間組成復雜的迷路型管道系統(tǒng)，成為溝通羊膜腔與羊膜基質的通道。同時，羊膜具有許多酶參與甾體激素代謝，減輕創(chuàng)面水腫；羊膜上皮中活性物質如IL受體拮抗劑、IL-10和基質金屬蛋白酶抑制劑等促進移植區(qū)多形核中性粒細胞凋亡，利于炎癥吸收[11]；某些可溶性細胞因子如抗新生血管化蛋白抑制新生血管長入，減少免疫細胞來源等。

2.4 抑制細菌生長，預防創(chuàng)面感染：Rejzek等[12]通過實驗觀察到羊膜覆蓋能抑制創(chuàng)面的細菌生長，其抑菌作用比同種異體皮大1 000倍，并認為羊膜對燒傷創(chuàng)面的抗感染能力主要是由于羊膜覆蓋創(chuàng)面造成一個閉合環(huán)境，防止了細菌污染，同時使機體本身的防御能力得以在局部發(fā)揮最大的作用。羊膜孔隙數(shù)平均為2×106/mm2，孔徑為0.3～3.4μm,可允許水分和一些小分子物質通過，而一般細菌不易通過直徑﹤5μm的孔隙[13]，使其成為保護創(chuàng)面的天然屏障。另表明，羊膜內含有抑菌因子、次級溶酶體、產生甾體類激素的酶等活性物質，可有效抑制細菌生長；羊膜上皮在細菌細胞壁的脂多糖或肽聚糖刺激下能產生β-防御素，β-防御素可能與天然免疫有關[14]。

2.5 減少創(chuàng)面瘢痕形成：經(jīng)隨訪，羊膜覆蓋后創(chuàng)面愈合處瘢痕增生不明顯，彈性及韌性良好，柔軟耐磨。有研究表明，炎癥是刺激瘢痕形成的原因[15]。羊膜通過不同的途徑抑制創(chuàng)面炎癥反應，從而起到抗纖維化，減少瘢痕的作用：羊膜可以抑制白細胞介素表達、調整炎性趨化因子表達、誘導多核白細胞凋亡；通過抑制轉化生長因子（transforming growth factor TGF）β的mRNA表達來抑制成纖維細胞的活性，減少瘢痕形成。基于下調TGF-β2信號系統(tǒng)降低瘢痕粘連的原理, Shah等[16]發(fā)現(xiàn)在切口周圍注射中和TGF-β2的抗體時能有效抑制瘢痕形成。此外，羊膜上皮細胞含有抗炎因子，可促進炎性細胞凋亡，抑制原有膠原過度分解，避免移植后炎性反應的發(fā)生[17－19]。Tseng等研究發(fā)現(xiàn)，羊膜可誘導TGR、P51，P52和P53等在創(chuàng)傷愈合中與成纖維細胞活動有關的信號下調，從而達到抗纖維化效果。Adinolfi等用免疫熒光技術證明人羊膜上皮細胞膜上不表達HLA-A、B、C及DR抗原，也不表達TGF-β2微球蛋白，而且體外羊膜上皮細胞與異基因淋巴細胞共培養(yǎng)時未見細胞毒T細胞產生，因而抗原性弱，同種異體移植排斥反應小。羊膜含有抗新生血管化蛋白，對新生血管有一定的抑制作用。

3羊膜的生物學改良

近年來，很多學者通過生物工程技術對羊膜進行生物學改良，改變羊膜結構（去羊膜上皮細胞或改變上皮細胞性質）及成分（吸附特殊藥物，使羊膜固有化學成分發(fā)生變化），在保持羊膜基本生理特性的同時賦予其更多的生物功能，取得一定成果。

3.1 生物復合型羊膜：以帶有活性組織細胞為主要特征的羊膜，主要用于各種原因所致的經(jīng)單純藥物治療或傳統(tǒng)羊膜移植術無效的嚴重創(chuàng)面。羊膜以其無毒性，良好的生物組織相容性，生物可降解性及降解可調節(jié)性，以及不引起機體免疫排斥反應，具有可塑性和一定的機械強度等生物學特性，成為組織工程中附載種子細胞的理想生物材料。羊膜附載骨髓間充質干細胞、表皮細胞、角質形成細胞、人胚胎干細胞和成纖維細胞等種子細胞的皮膚組織工程材料，在實驗和研究中已得到一定應用。

3.2 藥學羊膜：含有特定藥物成分的羊膜細胞外基質，根據(jù)所含藥物種類不同，又可細分為單一藥物型羊膜和復合型藥物羊膜。羊膜基底膜富含膠原纖維和網(wǎng)狀纖維，交織排列成網(wǎng)狀，網(wǎng)孔間隙0.5～15.0μm，能容納大量藥物分子，可吸附藥液作為“藥庫”。羊膜可自行降解，在較長時間內逐步釋放藥物，維持局部有效的藥物濃度，成為良好的膜控半定量釋藥系統(tǒng)。

3.3 生物復合型藥學羊膜：可稱其為超級羊膜。既載有活性組織細胞如角膜緣干細胞或多能干細胞，又含有特定藥物成分如抗生素或抗排斥藥物。

綜上，羊膜以其來源廣泛，利用方便，柔韌性好，易延展，免疫組織相容性好，能有效支持附載種子細胞并能誘導其分化，符合倫理學原則等優(yōu)點成為生物敷料及組織工程材料的理想選擇。隨著材料工程、生物工程、組織工程和基因工程等技術的不斷發(fā)展，克服羊膜質脆、易碎不耐壓以及易溶解等不足；尋找更能保持羊膜活性的人工羊膜制備及貯存方法；構建更加適于并能有效附載種子細胞及其分化所需生物環(huán)境的組織工程載體材料；通過基因修飾等技術對種子細胞進行有針對性的改良等都成為可能。總之，羊膜的生物學改良將得到更廣泛的研究和應用，羊膜上皮細胞，羊膜活性成分及羊膜外基質與不同的功能細胞、生物制劑、活性藥物相互組合應用，與新的技術完美結合，使各成分發(fā)揮其最大效應而構建復合型生物羊膜，應用于創(chuàng)面的修復與皮膚缺損的治療，必將組織修復帶入一個新的領域。

[參考文獻]

[1]Gris O, López-Navidad A, Caballero F, et al. Amniotic membrane transplantation for ocular surface pathology: long-term results [J]. Transplant Proc,2003, 35(5):2031-2035.

[2]Dua HS,Gomes JA,King AJ,et al.The amniotic membrane in ophthalmology[J]. Surv Ophthalmol,2004,49(1):51-77.

[3]Ravishanker R,Bath AS, Roy R."Amnion Bank"--the use of long term glycerol preserved amniotic membranes in the management of superficial and superficial partial thickness burns[J].Burns,2003,29(4):369-374.

[4]宋秀軍，陳代雄,江其生.人羊膜上皮細胞的研究進展[J].中國組織工程研究與臨床康復，2008，12（25）：4927-4930

[5]李潔英,湯青蘭,吳家蕓.冷藏羊膜在燒傷創(chuàng)面的臨床應用及組織學觀察[J].中華整形燒傷外科雜志，1985,2（1）：44.

[6] 陳瑞銘.動物組織培養(yǎng)技術及其應用[M].北京：科學出版社，1991：186

[7] 朱志軍,徐國士,趙 靜,等.牛羊膜在燒傷創(chuàng)面的臨床應用研究[J],中國修復重建外科雜志,2006,20（7）:735-738.

[8]Grueterich M, Espana EM,Tseng SC.Ex vivo expansion of limbal epithelial stem cells:amniotic membrane serving as a stem cell nichel[J].Surv Ophthalmol,2003,48(6):631-646.

[9]Mligiliche N,Endo K,Okamoto K,et al. Extracellularmatrix of human amnion manufactured into tubes as conduits for peripheral nerve regeneration [J].Biomed Mater Res,2002,63(5):591-600.

[10]張琪,顧曉明,俞光巖,等.復合雪旺細胞的羊膜衍生物膜修復神經(jīng)缺損的動物實驗[J].中華口腔醫(yī)學雜志,2006,41（2）：98-101.

[11]張琪,趙敏.異源性新鮮和保存羊膜移植后免疫相容性及組織學轉歸的比較研究[J].中國修復重建外科雜志，2008,22（5）：619-624.

[12]Rejzek A, Weyer F,Eichberger R,et al.Physical changes of amniotic membrane s through glycerolization for the use as an epidermal substitute. light and electron microscopic studies [J]. Cell and Tissue Bank,2001,2(2):95-102.

[13]Fujisato T, Toshia,Tomihata K,et al. Cross-linking of amniotic membranes [J]. Biomaterials Science, Polymer Edition,1999,10（11）：1171-1181

[14]Buhimschi IA,Jabr M, Buhimschi CS,et al.The novel antimicrobial peptide beta3-defensin is produced by the amnion:a possible role of the fetal membranes in innate immunity of the amniotic cavity[J]. Am J Obstet Gynecol,2004，191(5):1678-1687.

[15]Hunt,Thomas K,Hopf,et al. Physiology of wound healing[J].Advances in Skin & Wound Care,2000,13:6-11.

[16] Shah M, Foreman DM, Ferquson MW. Control of scarring in adult wounds by neutralising antibody to transforming growth factor beta[J].Lancet, 1992,339 (8 787) : 213 - 214.

[17] Hao Y, Ma DH, Hwang DG, et al. Identification of anti-angiogenic and anti- inflammatoryproteins in human amniotic membrane[J]. Cornea,2000,19(3): 348-352

[18]Park WC, Tseng SC. Modulation of acute inflammation and keratocyte death by suturing,blood, and amniotic membrane in PRK [J]. Inv Ophthalmol Visu Sci, 2000, 41(10): 2906-2914.

[19] Wang MX, Gray TB, Park WC, et al. Reduction in corneal haze and apoptosis by amniotic membrane matrix in excimer laser photoablation in rabbits[J]. Cat Refract Surg, 2001,27(2): 310-319.

[收稿日期]2008-10-21[修回日期]2008-12-30

編輯/張惠娟