ｂＦＧＦ表達在轉染ｂｃｌ－２基因治療大鼠局灶性腦缺血中的作用研究

[摘要] 目的 探討轉染bcl-2基因治療大鼠局灶性腦缺血的作用機制是否與bFGF蛋白的表達增加有關。方法 采用線栓法制作大鼠MCAO模型，取150只Wistar大鼠，隨機分成三組，分別為腦室內注射生理鹽水組（生理鹽水組）、腦室內注射空質粒組（空質粒組）和腦室內注射質粒pLXSN介導的bcl-2基因組（Bcl-2組）。每組50只。分別在缺血再灌注后3、6、24、48、72h觀察bFGF蛋白表達的變化。結果 大鼠MCAO后bFGF蛋白在生理鹽水組與空質粒組之間，缺血后各個時間點的表達均無顯著性差異（P＞0.05），結果顯示其表達高峰在缺血后24h，而bcl-2組早期即大量表達且持續(xù)較長時間，并在同一時間段表達明顯強于其他組（P＜0.05）。結論 pLXSN-bcl-2基因腦保護機制可能是通過促進bFGF的表達而實現(xiàn)的。

[關鍵詞] bFGF； bcl-2基因； 腦缺血； 基因治療

[中圖分類號] R743 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2009）13-34-02

Study of the Effect of the Expression of bFGF in Tranfected bcl-2 Gene Therapy of Cerebral Ischemia in Rat

XIAO Lijun1 HE Zhiyi2

1.The Third People’s Hospital of Liaoyang，Liaoning 111000；2.The First Affiliated Hospital of China Medical University，Shenyang 110001

[Abstract] ObjectiveTo study the protective effct of bcl-2 against neuroal injury and the possible roles of alteration in the expression of bFGF following cerebral ischemia in rat. Methods150 wistar rats were randomly assingned in 3 groups（bcl-2 treated group，saline group and pLXSN group），there were 50 rats in each group. And we studied the bFGF expression in 3，6，24，48，72hours after MCAO temporary ischemia of the MCAO for 2 hours was induced. ResultsTheexpression of bFGF in the saline group and pLXSN group weren’t different in each time（P＞0.05）， bFGF expressed early in the bcl-2 group and lasted for a long time，while its expression was more than other groups at the same time. ConclusionBcl-2 can effectivly attenuate ischemic brain injury and increase the expression of bFGF in the ischemic brain，indicating that the neuroprotective of estrogen is associated with up-regulation of bFGF in cerebral ischemia.

[Key Words]bFGF； bcl-2 gene； Cerebral ischemia； Gene treatment

近年來，腦血管病已成為目前人類疾病的三大死亡原因之一，而腦梗死是腦血管病中最常見的疾病之一，故對腦梗死的研究一直是神經科的重要課題。目前認為，缺血性腦血管病實際上是一個多因素參與的復雜病理過程。缺血后神經元的死亡有兩種形式，即凋亡和壞死，凋亡發(fā)生在許多細胞中，這一過程是細胞的主動性死亡，凋亡性細胞死亡是一個基因控制的過程，有RNA和蛋白質的合成[1]。在調節(jié)凋亡的基因中，bcl-2（B細胞淋巴瘤/白血病-2基因）是首先被發(fā)現(xiàn)有抑制凋亡作用的基因。目前許多學者將這種具有抗凋亡作用的基因用基因轉染技術進行實驗研究[2-5]，也得出相同的結論，近年來，堿性成纖維生長因子（bFGF）與bcl-2之間的關系日益受到人們的重視[5]，這也有利于進一步研究bcl-2抗凋亡的作用機制。現(xiàn)將我們的研究成果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

體重280～300g的Wistar大鼠150只（由中國醫(yī)科大學動物部提供），隨機分為腦室內注射生理鹽水組（生理鹽水組）、腦室內注射空質粒組（空質粒組）和腦室內注射質粒pLXSN介導的bcl-2基因組（bcl-2組）三組，每組又隨機分為缺血再灌注3、6、24、48、72h組。每小組動物10只。

1.2 大腦中動脈閉塞（MCAO）模型的制作

采用改良的Longa栓線法。全部大鼠統(tǒng)一采用栓塞右側大腦中動脈并于梗死后2h再灌注。

1.3 質粒pLXSN介導Bcl-2基因的制備方法

參照何志義等[6]在《質粒pLXSN介導人bcl-2 cDNA抑制局灶性腦缺血大鼠神經細胞凋亡》中描述的制備方法。

1.4 分組實驗

各組動物均于缺血再灌注后存活3、6、24、48、72h處死。

1.5 bFGF免疫組化分析

免疫組化分析采用SABC法。試劑來自武漢博士得公司。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（χ±s）表示，應用SPSS11.5軟件處理，采用t檢驗，P < 0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

bFGF蛋白的表達：在生理鹽水組與空質粒組之間，缺血后各個時間點的表達均無顯著性差異（P＞0.05），其表達高峰在缺血后24h，與文獻報道一致[7]。與空質粒組比較，bcl-2組在各個時間點的表達均顯著增加，表達高峰在缺血后3h，并持續(xù)至72h。見表1，圖1，2。

3 討論

Bcl-2是1984年Tsugimoto等[8]從濾泡性淋巴細胞瘤中分離出來的一種癌基因。Bcl-2作為抑制細胞凋亡的抗凋亡因子，已被許多實驗所證實。bFGF（Basic fibroblast growth factor）是FGF基因家族中主要成員之一，是一種具有多種生物學活性的神經營養(yǎng)因子。在腦組織中分布廣泛，它能誘導軸突向外生長，具有提高神經元、膠質細胞、內皮細胞的存活和生長，使更多的神經元在病理狀態(tài)下得以生存。增生的膠質細胞及損傷修復的神經元能產生更多的神經營養(yǎng)因子，促進顱腦損傷后的修復過程[9，10]。在正常情況下，腦內僅有少量bFGF表達。

目前，轉bcl-2基因治療缺血性腦梗死在實驗室研究階段取得了一定進展，但其作用機制卻不甚明確，有學者認為與抑制Ca2+釋放有關，也有學者認為bcl-2通過阻止促凋亡信號傳遞，或阻止這些誘導基因產物而發(fā)揮抗細胞凋亡作用，還有人認為bcl-2可通過抑制自由基而發(fā)揮抗凋亡作用。我們的實驗觀察到，在生理鹽水組與空質粒組，其bFGF蛋白在MCAO后3h即有表達，在24h 表達最強。而在實驗組，bFGF蛋白在缺血后3h即開始顯著表達，持續(xù)至72h，且各個時間點表達均比對照組明顯。

本實驗免疫組化的表達結果顯示，bcl-2組bFGF蛋白的表達在不同時間明顯強于二對照組，而且在3h明顯增強，持續(xù)高表達至72h。這表明，bcl-2的腦保護機制與bFGF的表達上調有密切關系，可能通過bFGF的釋放起到保護神經元、促進膠質細胞增生，改善缺血區(qū)血供以及促進新生血管形成等作用，從而影響神經功能的恢復。

綜上所述，bcl-2通過促進bFGF的表達，進而保護神經元、營養(yǎng)膠質細胞、促進新生血管形成等，從而實現(xiàn)其腦保護作用，可能是其抗凋亡作用機制之一，這為臨床治療缺血性腦梗死開辟了一條新的途徑，使基因治療成為可能，但如何更好地、真正地應用于臨床還需進一步的研究。

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（收稿日期：2009-03-03）