腺病毒－ＶＥＧＦ基因重組體促進預構(gòu)皮瓣成活的實驗研究

丁　志　鄭江紅　鄧智明　楊松林

[摘要]目的：應用大鼠預構(gòu)皮瓣模型，探討基因治療技術(shù)產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長因子促進預構(gòu)皮瓣血管新生和皮瓣存活的可能性，為臨床上尋找加速預構(gòu)皮瓣成熟的新方法提供實驗依據(jù)。方法：20只SD大鼠每只腹部兩側(cè)各構(gòu)建一個預構(gòu)皮瓣，共構(gòu)建40個皮瓣，每只大鼠兩側(cè)皮瓣按隨機原則進行不同的處理，分別歸于實驗組或?qū)φ战M，每組各20個皮瓣。于大鼠腹部兩側(cè)各標記3cm×2cm矩形預構(gòu)區(qū),短邊平行于腹股溝韌帶，自尾側(cè)短邊中點向后縱向切開后肢皮膚，剝離出長約2cm的股動靜血管束，遠端結(jié)扎切斷。在兩側(cè)預構(gòu)區(qū)域的中軸線上，于真皮與肉膜層間各制作一皮下隧道，實驗組的隧道壁皮下組織內(nèi)注射攜帶有VEGF基因的腺病毒，同法向所有對照組的隧道壁軟組織內(nèi)注射等量生理鹽水。將已剝離好的血管束向顱側(cè)翻轉(zhuǎn)置入相應皮下隧道內(nèi)。所有已植入股血管的預購區(qū)域2周后均被制成以植入血管束為蒂的島狀皮瓣，從兩組中各取一個皮瓣進行免疫組化染色，觀察有無VEGF生成，其余島狀皮瓣均縫回原處。形成島狀皮瓣后第七天觀察皮瓣存活及血管新生情況。結(jié)果：實驗組與對照組的皮瓣平均存活率分別為(90.48±1.89)%、(69.75±2.36)%，其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；血管放射顯影圖上，實驗組植入血管周圍見廣泛白色顯影，尤以血管兩端明顯，而對照組新生血管顯影僅局限于植入血管周圍；組織學切片顯示實驗組植入血管周圍新生血管豐富，以毛細血管為主，并見肉芽成份，對照組新生血管相對較少，兩組間新生小血管管腔大小則無明顯差異；免疫組化檢測顯示僅實驗組皮瓣中有VEGF表達。結(jié)論：腺病毒-VEGF基因重組體能通過促進預構(gòu)皮瓣的血管新生，增加預構(gòu)皮瓣的存活率。

[關(guān)鍵詞]血管內(nèi)皮生長因子；預構(gòu)皮瓣；基因治療；腺病毒

[中圖分類號]R622 Q813 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）03-0332-04

Improve survival of prefabricated flap with adenovirus vectors encoding for VEGF in rats

DING Zhi,ZHENG Jiang-hong,DENG Zhi-ming,YANG Song-lin

(Department of Plastic Surgery, the Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,

200233,Shanghai,China)

Abstract: Objective This study investigated the feasibility of local administration of adenovirus vectors encoding for VEGF to induce regional angiogenesis and improve the survival of prefabricated flap in rat prefabricated flap model, so as to provide experimental evidence for a new method with which we can accelerate maturation of prefabricated flap in clinics. Methods 40 prefabricated flaps were created on the left and right abdominal walls in 20 SD rats. Two prefabricated flaps in each rat were randomly allocated to experiment group or control group, and each group contains 20 flaps. In all animals, two 3cm×2cm rectangular skin flaps were designed obliquely on the abdominal wall so that the short side would lie parallel to inguinal ligament. Longitudinal incisions were made on both hind limbs starting from the midpoint of the short side down to the ankle. 2cm long femoral artery, vein were dissected as a bundle and ligated distally. A tunnel was created in the subcutaneous tissue between dermis and panniculus carnosus at the central axis of each planned skin flap. The subcutaneous tissue around the tunnel was injected with adenovirus vectors encoding for VEGF(Ad-VEGF) in experiment group, and with saline in equal amounts in control group. The prepared femoral vessel bundle was then turned over and passed through correspond tunnel. Two weeks later, abdominal island flap based solely on the implanted vessel was elevated. Select one flap from each group to observe the expression of VEGF. Other flaps were resutured into position. Flap viability and neovascularisation were evaluated on postoperative day 7 after the second surgical intervention. Results There was a significant increase in mean survival rate of prefabricated flaps in the Ad-VEGF group compared to the control group: Ad-VEGF, (90.48±1.89)%vs. saline, (69.75±2.36)(P<0.01). Microangiographic studies showed widespread neovascularisation around the pedicle-especially in the proximal and distal end-in experiment group, but new vessel formation is confined to the vicinity of the pedicle in control group; Histological examination done under high-power magnification(×100) revealed rich vascularity and mild inflammation surrounding the implanted vessel in experiment group, but small amount of new vessel was found in control group. The calibres of the new vessel from two groups were similar; Immunohistochemical stain showed that the VEGF was expressed in the survival tissue of the flap treated with Ad-VEGF, but it was not found in the control group. Conclusion Adenovirus-mediated VEGF gene therapy can increase the survival of prefabricated flaps through inducing regional angiogenesis.

Key words: vascular endothelial growth factor; prefabricated flap; gene therapy; adenovirus

預構(gòu)皮瓣應用中要解決的重要問題是知名血管植入預構(gòu)區(qū)域后，建立新的血供系統(tǒng)所需時間較長。近年來，有報導一些多肽類生長因子如VEGF（Vascular endothelial growth factor, 血管內(nèi)皮生長因子）、bFGF、TGF-β等[1-2]通過直接或間接刺激血管生成作用被用于促進預構(gòu)皮瓣的再血管化進程，特別是VEGF能特異性地促血管內(nèi)皮細胞分裂增殖、增加血管通透性,為血管內(nèi)皮的遷移及基質(zhì)形成創(chuàng)造條件，故備受研究者青睞。但生長因子蛋白半衰期短、療效不穩(wěn)定、需反復應用、副作用多，本研究應用基因治療技術(shù)，將人VEGFcDNA 通過腺病毒載體，一次性注射于大鼠腹部預構(gòu)皮瓣血管束周圍軟組織內(nèi)，通過觀察VEGF 的表達情況及對預構(gòu)皮瓣再血管化進程和成活的影響，探討腺病毒-VEGF基因重組體促進血管化和皮瓣成活的可能性。

1材料和方法

1.1 腺病毒-VEGF基因重組體的制備：重組復制缺陷型腺病毒pcDNA3/hVEGF165由中科院細胞所構(gòu)建。將hVEGF165插入pcDNA3的EcoRI和HindIII多克隆位點,并轉(zhuǎn)化DH5進行擴增，凝膠電泳證實hVEGF165已插入pcDNA3多克隆位點，測序證實hVEGF165無突變。以標準的磷酸鈣共沉淀法(Promega, Inc.Kit)轉(zhuǎn)染20ug pcDNA3/hVEGF165到PA317細胞，通過G418的集落篩選，擴大培養(yǎng)，測定包裝細胞上清中病毒的滴度，計算3個梯度中的cfu（clone forming unit），取最高cfu的包裝細胞系集落，在32℃的條件下培養(yǎng)48h。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示hVEGF16經(jīng)過EcoI和HindIII雙酶切后產(chǎn)生2個分別約5.4kb和560bp的hVEGF165片段，經(jīng)測序證實無突變，說明腺病毒-VEGF基因重組體構(gòu)建成功。

1.2 動物模型的建立：雄性SD大鼠20只，每只體重0.3～0.4kg，每只腹部兩側(cè)各構(gòu)建一個預構(gòu)皮瓣，共構(gòu)建40個皮瓣，每只大鼠兩側(cè)皮瓣按隨機原則進行不同的處理，分別歸于實驗組或?qū)φ战M，每組各20個皮瓣。1%的氯胺酮腹腔內(nèi)注射麻醉(1ml/100mg)、硫化鋇液脫毛及仰臥位固定后，于大鼠腹部兩側(cè)各標記3cm×2cm矩形預構(gòu)區(qū),短邊平行于腹股溝韌帶，自尾側(cè)短邊中點向后縱向切開后肢皮膚，在顯微鏡下仔細剝離出長約2cm的股動靜血管束，遠端結(jié)扎切斷。在兩側(cè)預構(gòu)區(qū)域的中軸線上，用18G注射器針頭于真皮與肉膜層間各制作一長2cm、寬0.3cm的皮下隧道，使用1ml注射器向?qū)嶒灲M的隧道壁皮下組織內(nèi)注射攜帶有VEGF基因的腺病毒，分4個點，每點注射0.1ml濃度為4×109cfu/L的pcDNA3/hVEGF165，同法向所有對照組的隧道壁軟組織內(nèi)注射等量生理鹽水。將已剝離好的血管束向顱側(cè)翻轉(zhuǎn)置入相應預構(gòu)區(qū)的皮下隧道內(nèi)，血管束末端用縫線固定于附近皮膚以防回縮，6-0絲線縫合切口（圖1），動物返回籠中。所有預構(gòu)區(qū)域2周后均沿前述腹部預構(gòu)區(qū)標記線切開皮膚，于肉膜層下方剝離形成以植入股血管束為蒂的島狀皮瓣，從兩組中各選一個皮瓣進行免疫組化染色，觀察有無VEGF生成，其余島狀皮瓣均縫回原處（圖2）。

1.3 檢測指標

1.3.1 免疫組化檢測：血管束植入預構(gòu)區(qū)域后2周，分別切取Ad-VEGF基因治療組和生理鹽水對照組中的一個預構(gòu)皮瓣進行免疫組化檢測：組織切片經(jīng)脫蠟、浸水處理后用H2O2處理（室溫，10min），應用羊血清封閉（37℃，30min）,直接滴加濃度為1∶100的抗人VEGF一抗（小鼠來源單克隆抗體，Santa Cruz公司，美國），4℃孵浴12h，PBS清洗，滴加二抗（生物素標記為山羊抗鼠，DAKO公司，丹麥），DAB（DAKO公司，丹麥）染色，光鏡下放大100倍觀察有無棕黃色顆粒表達從而確定有無VEGF蛋白生成。

1.3.2 皮瓣存活率：形成島狀皮瓣后第七天，按前述方法麻醉動物，相同物距下數(shù)碼相機拍照后，將圖像輸入KS400 圖像分析系統(tǒng)，經(jīng)圖像增強、分割、待測面積的二值化處理，精確測量皮瓣存活部分及壞死部分面積，根據(jù)公式：皮瓣存活率 = 皮瓣存活表面積/皮瓣總表面積×100%，算出兩組各19個皮瓣的存活率，再計算各組皮瓣存活率的均數(shù)。

1.3.3 放射顯影：島狀皮瓣拍照后，從兩組中各選取一個皮瓣，手術(shù)顯微鏡下解剖出蒂部股血管束，分別向兩側(cè)股動脈內(nèi)灌注60%泛影葡胺約3ml，結(jié)扎蒂部的股動靜脈并切下皮瓣，放射科拍攝鉬靶X光片，獲得植入血管及新生血管的放射顯影圖。

1.3.4 組織學觀察：島狀皮瓣拍照后，從兩組中各選取一個皮瓣，切下其存活部分后立即浸入10%甲醛溶液中固定48h，經(jīng)酒精梯度脫水二甲苯透明后石蠟包埋，萊卡切片機切成4μm薄片,蘇木精-伊紅染色封片，光鏡下放大100倍觀察植入的血管束周圍新生的小血管情況。

1.4 統(tǒng)計分析：數(shù)據(jù)表示為x±s,用SPSS 11.0 版統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，兩兩之間的比較采用t檢驗，P＜0.05示差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1大體觀察及皮瓣存活率：制成島狀皮瓣后，多數(shù)皮瓣邊緣出現(xiàn)程度不等的青紫腫脹，繼而顏色發(fā)黑干性壞死，有的破潰形成形狀各異的創(chuàng)面，一般5～7天后壞死范圍穩(wěn)定，成活與壞死界限分明，皮瓣成活區(qū)質(zhì)地均柔軟（圖3），兩個實驗組皮瓣局部可見皮下小血腫。VEGF基因治療組與生理鹽水對照組皮瓣平均存活率分別為(90.48±1.89)%、(69.75±2.36)%，兩組存活率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表1）。

2.2血管新生情況：血管放射顯影顯示，實驗組植入血管周圍見廣泛白色顯影，尤以血管兩端明顯，而對照組新生血管顯影僅局限于植入血管周圍(圖4)；HE染色組織學切片顯示實驗組植入血管周圍新生血管豐富，以毛細血管為主，并見肉芽成份，對照組新生血管相對較少，兩組間新生小血管管腔大小則無明顯差異(圖5)。

2.3免疫組織化學檢查：光鏡下放大100倍觀察來自兩組的免疫組化染色切片，VEGF基因治療組見到大量棕黃色顆粒表達,彌漫分布于新生小血管周圍，對照組切片上未看到棕黃色顆粒（圖6）。

3討論

植入血管與皮膚、皮下組織間建立起新的血液循環(huán)是預構(gòu)皮瓣成功的關(guān)鍵，新血管系統(tǒng)形成的速度、數(shù)量和范圍直接決定著預構(gòu)皮瓣的成熟時間和成活范圍，因此如何促進植入血管束多形成新生小血管并與皮瓣的小血管之間建立有效的吻合成為當前預構(gòu)皮瓣的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，一些多肽類生長因子能通過促進血管新生，從而促進缺血皮瓣的成活，1993年Iwasawa M[3]用TGF-β、 2000年Li QF[4]用VEGF來促進預構(gòu)皮瓣的成熟，也取得了預期效果。研究顯示，VEGF是迄今發(fā)現(xiàn)的作用最強的血管形成因子，能特異性地與血管內(nèi)皮細胞表面的相應受體結(jié)合，通過啟動有絲分裂原活化蛋白激酶來誘導內(nèi)皮細胞增殖[5]，其家族中VEGF165在體內(nèi)分布最廣，表達水平最高。由于VEGF在體內(nèi)的半衰期很短，一般不超過6min，必須反復使用才能發(fā)揮其血管生成作用，極為不便，不但增加感染機會，而且蛋白價格昂貴，這些情況限制了臨床應用前景。后來有人曾利用凝膠態(tài)的聚乙烯乙醇作為緩釋劑，試圖延長VEGF作用時間，發(fā)現(xiàn)并未提高VEGF的療效[6]。近年來，日漸成熟的基因重組和轉(zhuǎn)染等生物技術(shù)為VEGF保持其在局部的持續(xù)存在和作用提供了新穎的途徑：將VEGF基因插入到某種載體形成基因重組體，再轉(zhuǎn)染作用部位細胞，將VEGF基因帶入轉(zhuǎn)染細胞的細胞核內(nèi)，使得轉(zhuǎn)染細胞成為 VEGF 的“緩釋庫”，較長時間內(nèi)不斷產(chǎn)生VEGF蛋白，充分發(fā)揮其生物學效應。目前該基因治療技術(shù)已被報道用來改善缺血皮瓣的血供[7]以及提高自體顆粒脂肪移植成活率[8]，也有學者用于治療臨床上一些缺血性疾病[9]，取得了一定的療效。我們在此基礎上設想應用此項技術(shù)促進預構(gòu)皮瓣再血管化和增加皮瓣成活率，以便縮短預構(gòu)成熟時間。研究結(jié)果顯示，注射基因重組體后兩周時的實驗組標本切片免疫組化染色可見大量棕黃色顆粒，證實pcDNA3/hVEGF165已進入血管束周圍細胞內(nèi)并持久表達了VEGF蛋白，證明基因治療技術(shù)同樣能保持VEGF在預構(gòu)皮瓣中的持久存在。在HE染色組織切片及血管放射顯影的光鏡檢查中，實驗組標本的新生小血管較對照組的豐富，說明Ad-VEGF基因治療組在局部VEGF的持續(xù)刺激下，誘導形成了大量的新生小血管，有利于預構(gòu)皮瓣的存活，表現(xiàn)為治療組島狀皮瓣存活率高于對照組，這些結(jié)果說明應用基因治療技術(shù)產(chǎn)生VEGF促進預構(gòu)皮瓣成熟是可行的。

本研究采用腺病毒作為VEGF基因的載體，是因為其轉(zhuǎn)導效率高，而且腺病毒一般不與轉(zhuǎn)染細胞的染色體整合，故比較安全[10]。在HE染色組織切片上，治療組見到明顯炎性肉芽成份，這與以前的有關(guān)研究報導相符合，可能與腺病毒導致的宿主免疫反應[11]有關(guān)。研究中發(fā)現(xiàn)治療組一些皮瓣內(nèi)出現(xiàn)小血腫，可能是VEGF增加了局部血管通透性所致，所以尋找合宜的劑量和用藥濃度以最大程度的發(fā)揮其促血管生成作用而盡量避免副作用是今后研究的問題之一。

建立合理的實驗模型是研究預構(gòu)皮瓣再血管化的前提，以往的預構(gòu)皮瓣實驗研究中，多是先掀起隨意型皮瓣，然后將血管載體固定于皮瓣肉面，其缺點是手術(shù)創(chuàng)傷大，易引起嚴重纖維化影響預構(gòu)皮瓣的質(zhì)地；此外，掀起皮瓣還會因手術(shù)創(chuàng)傷觸發(fā)內(nèi)源性血管生長因子產(chǎn)生[12]，干擾對外源性VEGF發(fā)揮促進血管新生作用的觀察。本研究在一期手術(shù)中，并未掀起皮瓣，只是在預構(gòu)區(qū)域形成一包容血管束的皮下隧道，這無疑最大程度地減少了內(nèi)源性VEGF的產(chǎn)生，而且手術(shù)創(chuàng)傷小，保證了皮瓣質(zhì)地柔軟，操作也簡便，有臨床推廣價值。以往有研究認為，VEGF在非缺血組織中生物活性低[13]，本研究預構(gòu)區(qū)血液循環(huán)良好，VEGF同樣顯示了良好的促進血管新生作用，這也許和腺病毒誘發(fā)的炎癥反應有關(guān)。在剝離股血管束時，我們保留了少許管周組織，以防止損傷血管束內(nèi)動、靜脈之間的微細血管通道[14]，保證移位的血管束早期不致栓塞，但如果管周組織保留過多，一部分管周組織會因為早期缺血發(fā)生纖維化，從而妨礙血管束新生小血管。血管束植入動物肉膜層與真皮層之間，是因為肉膜層內(nèi)小血管網(wǎng)及真皮下血管網(wǎng)均較豐富，便于新生血管與其吻接溝通，同時制作島狀皮瓣時也提供了解剖標志。

總之，本研究證明基因治療方法能夠保持VEGF在預構(gòu)皮瓣中的持久存在，從而促進預構(gòu)皮瓣血管新生和皮瓣成活，未見明顯并發(fā)癥，為臨床上加速預構(gòu)皮瓣成熟提供了新的途徑。但腺病毒作為目的基因載體，是否會使人體基因發(fā)生突變，是否會導致病毒感染，以及如何提高基因轉(zhuǎn)染效率，尋找恰當?shù)慕o藥途徑、用藥劑量與濃度等問題尚需要繼續(xù)研究。

[參考文獻]

[1]Haws MJ,Erdman D,Bayati S,et al. Basic fibroblast growth factor induced angiogensis and prefabricated flap survival[J]. J Reconstr Microsurg,2001,17(1):39-42; discussion 43-44.

[2]Huemer GM,Shafighi M,Meirer R,Debagge P,et al. Adenovirus-mediated transforming growth factor-beta ameliorates ischemic necrosis of epigastric skin flaps in a rat model[J]. J Surg Res,2004,121:101-107.

[3]Iwasawa M.Accelerated maturation in prefabricated flaps by transforming growth factor-beta: an experimental study in the rabbit[J]. Ann Plast Surg,1993,31:7275.

[4]Li QF,Reis ED,Zhang WX,et al. Accelerated flap prefabrication with vascular endothelial growth factor[J]. J Reconstr Microsurg,2000,16(1):45-49.

[5] Gerber HP,McMurtrey A,Kowalski J,et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol232kinase/akt signal transduction pathway[J]. Requirement for flk21/kdr activation[J]. Biol Chem,1998,273(46):30336-30343.

[6]李青峰,平萍,張滌生.血管內(nèi)皮生長因子促進預構(gòu)皮瓣成活的實驗研究[J].中華整形外科雜志,2002,18(2):69-71.

[7]Gurunluoglu R,Ozer K,Skugor B,et al.Effect of transfection time on the survival of epigastric skin flaps pretreated with adenovirus encoding the VEGF gene[J]. Ann Plast Surg,2002,49:161-169.

[8]劉宇蘭,張一鳴,聶祝峰,等.重組人VEGF 基因治療提高游離顆粒脂肪移植存活率的實驗研究[J].中國美容醫(yī)學,2005,14(3):271-274.

[9]Jewell RP,Whitney TM.TRAM fat necrosis in an yong surgeon′spractice:is it experience,technique or blood flow[J].Ann Plast Surg,1999,42(4):424-427.

[10]Yla-Herttuala S, Martin JF. Cardiovascular gene therapy[J]. Lancet,2000,355:213-222.

[11]Tripathy SK, Black HB, Goldwasser E, et al. Immune responses to transgene encoded proteins limit the stability of gene expression after injection of replication-defective adenovirus vectors[J]. Nat Med,1996,2:545-550.

[12]Kostakoglu N, Manek S, Green CJ. The development of neovascularisation in flap Prefabrication with vascular implantation: an experimental study[J]. Br J Plast Surg,1997,50:428-434.

[13]Padubidri A，Browne E. Effect of vascu1ar endothelial growth factor(VEGF)0n survival of random extension of axial pattern skin flaps in the rat[J]. Ann Plast Surg,1996,37:604-610.

[14]沈祖堯,王旭春,蘆家澤,等.血管束移位形成軸型皮瓣的實驗研究[J].中華外科雜志,1981,19(11):692-695.

[收稿日期]2008-12-29[修回日期]2009-02-06

編輯/張惠娟