Ｅ－選擇素基因多態性與新疆哈薩克族原發性高血壓的相關性研究

鄭維威　郭清江　張麗翠　蔡偉娟　劉　旻　吳雪花　黃瑾　謝建新　周祖釗　何　芳　馬雅靜　程　江

【摘要】 目的 探討E-選擇素(E-selectin)基因第2外顯子+G98T和第4外顯子+A561C位點單核苷酸多態性在新疆哈薩克族人群中的分布，并分析E-selectin基因多態性與原發性高血壓的相關性。方法 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)的分析方法，檢測了新疆哈薩克族人群無血緣關系的150例原發性高血壓患者和150名對照者E-selectin基因+G98T位點及+A561C位點多態性,同時用生化分析儀檢測相關生化指標。結果 ①新疆哈薩克族人群中E-selectin基因+G98T多態性位點存在GG、GT二種基因型，其中以GG基因型發生頻率最高(91.3%)，GT基因型頻率次之(8.7%)；同時也存在AA、AC二種基因型，其中以AA基因型發生頻率最高(88.0%)，AC基因型頻率次之(12.0%)；②E-selectin AC基因型在高血壓組和對照組間的分布差異存在顯著性(χ²=5.31，P<0.025)。結論 新疆哈薩克族人群中存在E-selectin+G98T和+A561C兩位點單核苷酸多態性，其中A561C基因多態性與原發性高血壓具有相關性，C等位基因可能是新疆哈薩克族原發性高血壓發病的遺傳易感基因。

【關鍵詞】 E-選擇素; 基因多態性；哈薩克族；高血壓

基金項目：新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室開放基金資助課題（項目編號：2005-07），石河子大學醫學院第一附屬醫院資助課題（項目編號：2009-03）

作者單位：832003石河子大學新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室(鄭維威 郭清江 張麗翠 蔡偉娟 劉旻 黃瑾 謝建新 周祖釗 何芳);

石河子大學醫學院第一附屬醫院檢驗科(鄭維威 郭清江 張麗翠 蔡偉娟 劉旻 吳雪花 馬雅靜 程江);

石河子大學醫學院生物化學與分子生物學教研室(黃瑾 謝建新 周祖釗);

石河子大學醫學院病理生理學教研室(何芳)

Correlationof E-selectin gene polymorphisms in Xinjiang Kazak people with essential hypertension

ZHENG Wei-wei,GUO Qing-jiang,ZHANG Li-cui,et al.

Dept.of Clinical Laboratory,Shihezi University,Xinjiang 832008，China

【Abstract】 Objective To study the correlation of the +G98T polymorphism in the exon2 and the +A56lC polymorphisms in the exon 4 of E-selectin gene in Xinjiang Kazak people and the association with essential hypertension(EH). Methods Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) method was used to determine +G98T and S128R loeus mutation. Polymorphisms in E-selectin gene in 150 EH Patients and 150 controls. Automated Biochemieal Analyzer was used to measure the clinical biochemistry datas. Results ①Two genotypes AA and AC of E-selectin A561C polymorphisms，GG and GT genotypes of E-selectin G98T polymorphisms were found in Xinjiang Kazak people.②There was significant difference in frequencies of genotype in E-selectin A561C polymorphisms between essential hypertension and control group P<0.05.Conclusions E-selectin A561C amd G98T polymorphism exists in Xinjiang Kazak people. There is a correlation between E-selectin A561C polymorphism in Xinjiang Kazak people with essential hypertension.CAllele may be one of predisposing factor of Xinjiang Kazak people with essential hypertension.

【Key words】 E-selectin; Gene polymorphism;Kazak people; Hypertension

原發性高血壓是一種多基因、多因素綜合作用而導致的常見疾病,呈遺傳易感性與環境因素相結合的發病模式。現研究熱點圍繞尋其相關基因展開,炎性反應與自身免疫是否為高血壓的發病原因也引起了人們的關注。炎癥細胞因子E-選擇素(E-selectin) 及其部分基因多態性被證明與高血壓相關,但E-選擇素第4外顯子A561C和第二外顯子G98T基因多態性對高血壓的影響報道不多,本文對其與新疆哈薩克族高血壓的相關性進行了研究。

1 資料與方法

1.1 研究對象 高血壓組150例,男55例,女95例。來自新疆沙灣縣相對閉塞的牧區，經過心血管科副主任醫師確診的高血壓患者,并排除繼發性高血壓、心肌病、瓣膜疾病、先天性心臟病。均符合1999年WHO的高血壓診斷標準。對照組:150例,男55例,女95例。均為健康體檢者,無高血壓病家族史,并進行有關檢查排除了高血壓、心肌缺血、糖尿病等疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑盒法抽提基因組DNA（試劑盒來自上海生工生物技術公司）,采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性( PCR-RFLP) 方法進行DNA多態性分析。

1.2.2 引物設計與合成 提取人類基因組DNA,參考相關文獻^［1，2］設計一對引物(引物由上海生工生物公司合成)。

1.2.3 PCR擴增 PCR 擴增體系為25 μl,模板DNA2 μl,上下游引物各0.7 μl,10 ×Buffer2.5 μl,Mg2+2 μl,dNTPs0.5 μl,Taq-DNA 聚合酶0.3 μl (以上均由上海生工生物公司提供) ,雙蒸水補足至25 μl。應用英國Hybaid Express全自動PCR擴增儀,先94℃預變性5 min,94℃變性30 s,61℃退火30 s,72℃延伸45 s,35個循環,最后72℃再延伸10 min。

1.2.4 限制性核酸內切酶酶切 PCR 擴增產物10 μl,PstⅠ、HphⅠ(由上海生工生物公司提供) 2 μl ,10×Buffer 2 μl,雙蒸水補足至20 μl。37℃水浴5 h進行酶切反應。

1.2.5 電泳判斷基因型及測序 酶切產物點樣至含溴乙淀的3%瓊脂糖凝膠,120 V,電泳40 min后,在紫外燈下檢測照相,經美國Kodak凝膠成像系統觀察片段電泳圖。對各基因型抽樣測序(送上海生工生物公司)核實基因型。

1.2.6 對照組及高血壓患者臨床生化指標檢測 采用日立7170型全自動生化分析儀檢測清晨空腹肘靜脈血FBG、TG、TC、LDL 、HDL 、UA、CRE、ALT 等常規血液生化指標。定標物均為國外原裝試劑，保證線性范圍在控。

1.2.7 統計學方法 所有計量數據以均數±標準差（x±s）表示,計數資料以頻數表示。采用SPSS 11.5 統計軟件進行數據分析。Hardy-Weinberg 檢驗、OR 計算、基因頻率之間的比較采用四格表χ²檢驗;不同基因型的動態血壓差異采用兩獨立樣本的t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

3 討論

E-選擇素(E-selectin)是黏附分子選擇素家族主要成員之一,為細胞表面糖蛋白,分子量為115 kD,由589個氨基酸殘基構成,僅表達于細胞因子活化的內皮細胞表面,它是體內的一種促炎細胞因子,參與多種白細胞，包括粒細胞、巨噬細胞、單核細胞等以CD4⁺記憶性 T細胞亞群的黏附與聚集,它在免疫、炎性反應及動脈粥樣硬化的形成過程中起著重要作用^［3,4］。E-selectin基因位于第1號染色體長臂上,為一段長13 kb、DNA序列,含14個外顯子和13 個內含子。有研究證實 E-selectin基因第2 和第4 外顯子分別存在G/T和A/C多態性,這兩種多態性可能影響E-selectin基因表達和功能,并可能與心血管疾病有密切關系^［1,5］。

1994年德國學者Wenzel等^［6］首先證實E-選擇素第4外顯子基因中第561位堿基因腺嘌呤(A)P胞嘧啶(C)(A561C)的轉換,導致其分子128位氨基酸由絲氨酸(Ser)變成精氨酸(Arg)(S128R),這種基因多態性的存在可能影響E-選擇素基因表達和生物學功能,進而影響到體內E-選擇素的生物學作用。研究^［7］還發現E-選擇素水平與其基因型有關,含C等位基因者E-選擇素水平高于含A等位基因者。由此猜測,E-選擇素基因多態性可能影響其在內皮細胞上的表達,基因結構的改變可能帶來蛋白質功能的變化。

近來研究證實循環中炎癥細胞因子E-選擇素濃度與血壓有關,而且E-選擇素Leu554Phe(L/F554)多態性、第2外顯子G98T基因多態性也與血壓有關聯^［8］。這明確表明炎癥細胞因子E-選擇素可以對高血壓產生影響。目前發現E-選擇素第4外顯子A561C基因多態性與非胰島素依賴型糖尿病、系統性紅斑狼瘡的相關性^［9,10］。而且這種多態性已被證實與歐美白人CAD有關^［2］。E-選擇素A561C基因多態性在控制了諸多混雜因素的作用后仍是T2DM并發CHD可能的獨立危險因子^［9］。其機制可能與A561C等位基因參與調控內皮細胞表達E-選擇素有關。通過基因型的檢測篩查CAD的高危人群,將有助于早期發現和防治CAD及動脈粥樣硬化。但其與高血壓的相關關系罕見報道。

本文首次報道了新疆哈薩克族E-選擇素第四外顯子A561C基因多態性和第二外顯子G98T多態性與原發性高血壓的相關性。本研究發現,E-選擇素A561C基因型構成比在高血壓組與對照組之間有顯著性差異（P<0.025）,即C等位基因發生高血壓的風險性是A等位基因的2.063倍。但是E-選擇素G98T基因多態性與新疆哈薩克族原發性高血壓沒有相關性，尚不能認為T等位基因是新疆哈薩克族原發性高血壓的易感基因。

推測E-選擇素A561C基因型對血壓的這些影響,可能源于第561位堿基因腺嘌呤A/胞嘧啶C的轉換,導致其分子128位氨基酸由絲氨酸變成精氨酸后,造成蛋白質功能的變化,進而影響E-選擇素基因在內皮細胞上的表達和生物學功能。由于循環中炎癥細胞因子E-選擇素濃度與血壓有關,因此E-選擇素基A561C轉換可能改變了E-選擇素的分泌數量而導致高血壓。由于E-選擇素基因第四外顯子編碼E-選擇素表皮生長因子樣結構域,發生在這一區域的A56lC轉換很可能會改變表皮生長因子樣結構域,從而改變E-選擇素分子介導的黏附作用。進一步由E-選擇素的分泌數量和黏附作用的改變如何發展至高血壓,目前尚無定論。現推測可能與微循環異常有關^［11］。研究表明,微循環的結構和功能的改變可能源于并促進血壓增高。高血壓時,小的阻力動脈出現結構改變與重塑,如管壁/管腔比值增大,不同血管床的毛細血管網變稀少。這些改變可通過增加外周阻力維持并促進血壓的升高。有證據表明,在高血壓時觀察到的至少部分微血管的變稀薄與血管重構、微血管生成減少有關^［12-14］。而E-選擇素影響著微循環的完整性,它在白細胞與內皮細胞間的相互作用已經得到公認。白細胞與內皮細胞間的黏附性增強反過來由于移動聚集的白細胞產生的大量細胞素和酶促產物的作用,可導致平滑肌細胞的重構等微血管改變。

在我國,對于E-選擇素基因多態性的研究報道較少。本研究應用PCR-RFLP的方法檢測了新疆哈薩克族E-選擇素基因A561C、G98T的多態性。在我國新疆哈薩克族人群中A等位基因頻率（89.7%）與德國（91.3%）^［15］、美國（84.6%）^［16］和英國（88.6%）^［9］沒有太大的差異，但與我國北京地區(97.8%)^［17］、武漢地區(97.0%)^［18］則有顯著性差異；G等位基因頻率（95.7%）與我國武漢地區漢族人群（92.5%）^［18］沒有顯著性差異。說明E-選擇素基因多態性分布在不同種族間存在差異。了解我國人群中E-選擇素基因多態性的分布,不僅為進一步研究我國人群中高血壓的發生發展與E-選擇素基因多態性間的關系提供理論依據,也將有助于更深入地理解高血壓在不同種族間所具有的不同發病率和臨床特點的基因背景。E-選擇素基因多態性與高血壓的研究才剛起步,還有待進行大樣本、多地域、多民族廣泛深入的研究。

參考文獻

［1］ Ellsworth DL, Bielak LF, Turner ST, et al.Gender and age dependent relationships between the E-selectin S128R polymorphism and coronary artery calcification. J Mol Med,2001,79:390-398.