替硝唑在蜂蜜中殘留量的檢測方法和停藥安全期的研究

吳 格 陳圣崴 陳 明

摘要蜂蜜中替硝唑藥物使用的停藥安全期和殘留量的高效液相色譜檢測方法的試驗研究結果表明,替硝唑濃度在0.05～2.50μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系,平均回收率為93.4%~99.1%,相對標準偏差為1.27%~5.31%,最低檢測限為0.01μg/mL。該方法簡便、快速、準確。替硝唑施藥濃度為2.0g/L時,停藥安全期是15d以上;施用濃度5.0g/L時,停藥安全期是25d以上。

關鍵詞蜂蜜;替硝唑;殘留量;高效液相色譜;停藥安全期

中圖分類號S859.84 ;S896.8 文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)21-0287-03

我國蜂產品年產量及出口量均居世界前列。但由于蜂產品中農獸藥物殘留超標,出口屢屢受阻。進口國紛紛采取了封關、扣留及銷毀產品等措施。給我國養蜂業造成巨大影響。近幾年,中國加強了對蜂產品中藥物殘留的控制管理。雖然目前歐盟等國有限度解除了對中國蜂產品的進口禁令,但它對進口的蜂產品質量標準不斷提高,其中的禁用藥物種類逐年增加。因此,為了應對國外的“綠色壁壘”,也為了提高我國蜂產品的產品質量,要加強蜂產品中藥物殘留研究工作的技術儲備,迅速提高自身水平,主動適應國際間對此類產品日益提高的質量標準要求。

南京外國語學校科研實習小組在飼養蜜蜂的觀察研究試驗中,了解到蜜蜂爬蜂病是我國近年來西方蜜蜂普遍發生的疾病,秋冬兩季尤為嚴重,患病蜜蜂輕者群勢迅速削弱,重者全群覆滅,給蜂農帶來巨大損失。以前蜜蜂爬蜂病主要使用氯霉素、甲硝唑治療,在國家明令禁止在農業生產中使用氯霉素、洛硝達唑等藥,歐盟又禁用甲硝唑后,沒有列為禁藥的替硝唑成為治療爬蜂病的主要藥物。替硝唑(Tinidazole)別名磺甲硝咪唑(Fasigyn),是一種人工合成的抗生素,屬于硝基咪唑類藥物,具有抗厭氧菌和抗原蟲的作用。它單獨使用或和其他藥物配合使用,對防治各種蜂病都有一定療效,因此目前在我國養蜂業生產中廣泛應用。我國和歐盟、日本、美國對抗生素藥物在動物源食品中的使用及殘留都有相應的規定,但對于取代氯霉素、甲硝唑成為防治蜜蜂爬蜂病主要藥物之一的替硝唑,我國目前還沒有關于蜂蜜中替硝唑殘留量測定的國家、行業或地方檢測方法標準,也沒有相應的藥物使用規范。蜂農經常根據經驗自行添加使用,也沒有相應的停藥安全期。往往造成蜂產品中藥物殘留超標,影響蜂蜜產品品質。

目前國內外對替硝唑分析檢測方法,主要有紫外分光光度法、熒光分光光度法、酶聯法、液相色譜法、火焰原子吸收光譜法、膠束薄層法等。多出現在對替硝唑原料藥和成藥的檢測,以及藥物在人體中的藥物動力學和藥物代謝檢測研究。筆者采用高效液相色譜法檢測蜂蜜中替硝唑的殘留量,樣品經溶劑提取、離心沉淀、凈化、濃縮。在C18色譜柱上分離,紫外檢測器測定,可以一次性定性定量檢測蜂蜜中替硝唑的藥物殘留量,方法簡單快捷,為研究替硝唑在蜂蜜中的藥物殘留消減規律提供了技術依據。該試驗研究了在飼養蜜蜂過程中,當施用不同濃度的替硝唑藥液后,蜂蜜中替硝唑殘留量的消減規律。初步確定不同替硝唑施藥濃度的停藥安全期。

1材料與方法

1.1儀器設備、藥品及試劑

Agilent1100S高效液相色譜儀(美國,Agilent公司),配備四元泵,二極管矩陣檢測器(DAD);Lamda25紫外分光光度計(美國,PE公司);N-EVEP 112氮吹儀(美國,Organom ation Associates公司);Milli-Q超純水器 (美國,MILLLIPORE公司)等。

替硝唑標準品:≥99.5%(Sigma公司產品);所用試劑磷酸氫二鉀、乙酸乙酯、鹽酸等為分析純,甲醇為色譜純,水為超純水。

1.2各種溶液的配制

替硝唑標準儲備液:準確稱取替硝唑標準品0.100 0g,用甲醇溶解,定容至100mL棕色容量瓶,此替硝唑標準儲備液濃度為1mg/mL。放置4℃冰箱中保存,可以使用2個月。

標準工作液:吸取適量的標準儲備液,用甲醇∶水(20/80;V/V)溶液稀釋至所需的質量濃度。置于4℃條件下避光保存,有效期為20d。

1.3色譜檢測條件

高效液相色譜儀配備二極管矩陣檢測器,檢測波長316nm;色譜柱為ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm,i.d,5μm),柱溫25℃;流動相:甲醇+水=20+80;流速1.0 mL/min,樣品進樣量為20μL。

1.4試驗方法

將替硝唑原藥用水配制成2.0g/L、5.0g/L 2種濃度的溶液,對無藥物污染的新蜂巢脾板分別進行噴霧施藥后,放入2個不同的蜂箱,替換出舊的脾板。然后每天施藥1次,共計3d。停藥后第3天、第8天、第15天、第25天采集脾板上的蜂蜜,檢測其替硝唑藥物殘留含量。

1.5樣品處理

準確稱取10.0g(精確至0.001g)混勻的蜂蜜,放入50mL離心管,加入10mL超純水,振蕩溶解。加入磷酸氫二鉀5g,漩渦振蕩5min使其溶解。加入10mL乙酸乙酯萃取,漩渦振蕩5min,高速離心(10 000rpm)5min。吸取上層有機相;分別用8mL、4mL乙酸乙酯重復萃取操作步驟2次。將3次有機相合并后使用氮氣吹干儀在40℃水浴下吹干,用1mL的20%甲醇水溶液溶解定容,用0.22μm針式濾器過濾,最后用高效液相色譜儀測定。

樣品加標試驗:稱取空白樣品后,加入適量濃度的替硝唑標準溶液,其他處理步驟同上。

2結果與分析

2.1色譜分析條件

2.1.1檢測波長的選擇。用紫外可見分光光度計對替硝唑標準品溶液進行全波長掃描(190～600nm),檢測波長選擇試驗結果表明,替硝唑在190～600nm范圍內最大吸收峰在316nm處。因此,選擇高效液相色譜儀二極管矩陣檢測器(DAD),檢測波長為316nm,同時可以避免低波長紫外下雜質干擾檢測。

2.1.2流動相對替硝唑分離的影響。在高效液相色譜的分析中,流動相中甲醇濃度為5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%變化時,替硝唑在C18反相分析柱上的保留時間變短。甲醇濃度太低,分析時間延長,替硝唑峰形變寬拖尾;甲醇濃度太高,分析時間太短,樣品中干擾物質和替硝唑的分離不好。經過試驗,甲醇濃度以20%為宜。

2.1.3溫度對保留時間的影響。研究發現,不同的分析柱溫會使替硝唑色譜圖出峰保留時間變化,實驗室環境溫度變化也是干擾色譜分析條件的因素之一,影響分離效果和檢測準確性,應該引起試驗測試者足夠重視。因此,該試驗建議分析檢測方法,分析柱溫設定為25℃,液相色譜儀器實驗室溫度也應控制在恒溫條件下開展(23~25℃)。

2.2標準工作曲線及檢出限

準確吸取一定體積的替硝唑標準儲備液,用20%甲醇水溶液逐級稀釋,分別配制成濃度為0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.80μg/mL、1.60μg/mL、2.50μg/mL的替硝唑標準工作液,此溶液現配現用。按上述的色譜分析條件,每個濃度測定3次,取測得的峰面積平均值和替硝唑的濃度關系作線性回歸分析,結果表明:替硝唑質量濃度(C)在0.05～2.50μg/mL范圍內與峰面積(A)呈良好的線性關系,線性回歸方程為:C=0.028 8A-0.001 89,相關系數r2=0.999 8。

在藥物殘留的檢測中,檢測限是主要的技術指標之一。是考察檢測替硝唑殘留量的最低濃度有效值。以3倍于噪音峰高的替硝唑濃度響應值作為最低檢測限,該分析條件下替硝唑的最低檢測限為0.01μg/mL。

2.3樣品前處理方法

高效液相色譜分析,需要對樣品進行一定的處理和凈化、富集。以減少雜質對分離檢測時的干擾和提高藥物殘留的檢測限。因此,需要研究樣品的前處理條件,以凈化除去可能會干擾檢測的樣品基質中雜質。液液萃取法是化學分析中常用的分離方法,目前國內外有關硝基咪唑類藥物分析樣品前處理使用最廣的提取溶劑一般有乙酸乙酯、乙腈、甲苯和二氯甲烷。二氯甲烷毒性較大;而通常情況下,乙腈與水相互溶,不便于進一步分離提取目標物。因此,選擇采用乙酸乙酯作為蜂蜜中替硝唑的萃取溶劑。通過振蕩、超聲、高速離心的方法進行提取分離。

蜂蜜樣品在添加水溶解后直接用乙酸乙酯提取,發現高速離心后,兩相液面有較厚的乳化層,影響萃取分離。當添加一定的磷酸氫二鉀鹽后,乳化層減弱。為了研究添加磷酸鹽對液液萃取效率的影響,試驗設計了2g、5g、10g等3種添加量。考察了對方法回收率高低的影響。根據試驗結果(見表1),建議采用添加5g磷酸氫二鉀。

2.4回收率

在上述色譜條件下,分別在未含替硝唑藥物殘留的空白蜂蜜樣品中,添加0.01mg/kg、0.04mg/kg、0.16mg/kg 3個濃度水平的替硝唑標準品。每個濃度水平做3個重復。測得蜂蜜中替硝唑的平均回收率為93.4%~99.1%,相對標準偏差為1.27%~5.31%。表明該方法準確度和精確度能滿足蜂蜜中替硝唑殘留的分析要求(見圖1、圖2)。

2.5停藥安全期

將采集的蜂蜜樣品按確定的試驗條件處理并通過高效液相色譜分析檢測,結果見表2、表3。

從試驗結果可以初步看出,施用替硝唑后,蜂蜜中替硝唑的濃度含量隨著時間逐漸消減。2.0g/L濃度的替硝唑原藥施用后,在15d后蜂蜜中的替硝唑殘留量消減到不能檢出,而5.0g/L濃度的替硝唑原藥施用后,到第25天蜂蜜中替硝唑殘留量消減到不能檢出。因此,可以初步確定當替硝唑的施藥濃度是2.0g/L時,停藥的安全期是15d以上。而當施用5.0g/L濃度的替硝唑藥液時,停藥的安全期是25d以上。

3結論與討論

試驗建立了蜂蜜中替硝唑藥物殘留的高效液相色譜檢測方法和樣品分離、純化、富集的前處理方法。檢測中基本無雜質干擾檢測,樣品峰分離效果好,具有特異性強、靈敏度高等優點。替硝唑濃度在0.05～2.50μg/mL范圍內時,濃度與峰面積呈良好的線性關系。在空白樣品中添加替硝唑濃度為0.01mg/kg、0.04mg/kg、0.16mg/kg時,替硝唑的平均回收率為93.4%~99.1%,相對標準偏差為1.27%~5.31%。符合殘留檢測要求。檢驗過程樣品處理步驟簡單,分析時間短,結果穩定、準確、可靠,可滿足對蜂蜜中替硝唑藥物殘留量的檢測。替硝唑的藥物施用試驗,初步探討了該藥物在防治蜂病時的藥物施用濃度和停藥安全期,為加強蜂產品的藥物使用監管和殘留監測,保證蜂產品質量提供一定的技術依據,能夠提高我國蜂產品的出口競爭力,從而使我國的蜜蜂產業突破國外的“技術壁壘”,順利地跨出國門,走向世界。

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