不同方法檢測(cè)食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌比較

蘇靖華

單核細(xì)胞增生李斯特菌廣泛分布于自然界，污染肉禽類、乳類、魚貝類及蔬菜等食品引發(fā)食物中毒。新生兒、高齡孕婦和免疫力低下者易感染，主要引起腦膜炎和敗血癥，死亡率較高。美國(guó)、英國(guó)、加拿大等國(guó)多次爆發(fā)由該菌污染空心菜、奶酪等引起食物中毒，病死率達(dá)30％以上。

一般基層單位主要采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌，常規(guī)檢測(cè)流程從分離、培養(yǎng)、鑒定都沿用傳統(tǒng)方法，需要6～7 d甚至更長(zhǎng)，菌落形態(tài)識(shí)別難，受主觀人為因素影響大，陽(yáng)性率低。近年來(lái)發(fā)展出新型顯色平板、API生化鑒定試劑及PCR技術(shù)等快速檢測(cè)方法，提供了更快捷高效的檢測(cè)手段。為探索更優(yōu)化的單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測(cè)方法，我們對(duì)從區(qū)內(nèi)食品污染物監(jiān)測(cè)點(diǎn)采集6類361件食品樣品，選用3種方法檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌，并對(duì)這幾種方法進(jìn)行比較。お

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

從區(qū)內(nèi)集貿(mào)菜場(chǎng)、大中型超市采集各類食品，包括生畜禽肉、熟肉制品、豆制品、水產(chǎn)品、速凍米面制品、生食蔬菜共6大類361件樣品。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

李氏增菌肉湯、TSA-YE瓊脂、EB增菌液，MMA瓊脂、SIM動(dòng)力培養(yǎng)基、血瓊脂、各種糖發(fā)酵培養(yǎng)基等均為上海市疾病預(yù)防控制中心提供的干粉制品，使用時(shí)按說(shuō)明書配制而成。李斯特菌顯色平板為科瑪嘉公司生產(chǎn)的成品。API Listeria 10300生化鑒定試劑盒由法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)。PCR試劑盒由佳寧科技公司生產(chǎn)。以上培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 檢驗(yàn)方法

1.3.1 食品微生物檢驗(yàn)（方法1） 按照食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)GB/T4789.31—2003的方法，取檢樣25 g打碎，加入225 mL LB₁增菌液混勻，于30℃環(huán)境培養(yǎng)24 h，吸出0.1 mL加入10 mL LB₂增菌液中，再于30℃環(huán)境培養(yǎng)24 h。分離MMA平板,于30℃環(huán)境培養(yǎng)48 h,挑5～6個(gè)可疑菌落接種三糖鐵瓊脂和SIM動(dòng)力培養(yǎng)基。選擇三糖鐵瓊脂上、下層產(chǎn)酸、動(dòng)力呈傘狀者在TSA-YE平板上純培養(yǎng)，進(jìn)一步作染色鏡檢、溶血試驗(yàn)和各種傳統(tǒng)生化試驗(yàn)。

1.3.2 食品污染監(jiān)測(cè)（方法2） 按照上海市食品污染物監(jiān)測(cè)方案的方法，2次增菌后，分離科瑪嘉李斯特菌顯色平板，于36℃環(huán)境培養(yǎng)24 h，挑5～6個(gè)可疑菌落接種木糖、鼠李糖，同時(shí)在TSA-YE平板上純培養(yǎng)。選擇木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性的純培養(yǎng)物進(jìn)一步作染色鏡檢、生化試驗(yàn)等，生化試驗(yàn)用API Listeria 10300生化鑒定試劑盒。

1.3.3 PCR篩選法（方法3） 對(duì)LB₂增菌液用美國(guó)Opticon2熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特菌篩選，陽(yáng)性者按1.3.2方法分離科瑪嘉李斯特菌顯色平板后培養(yǎng)驗(yàn)證。お

2 結(jié)果

2.1 不同方法檢測(cè)結(jié)果

方法1檢測(cè)361件樣品，其中2件檢出單核細(xì)胞增生李斯特菌（生畜禽肉1件，速凍米面制品1件），陽(yáng)性率為0.55％。方法2檢測(cè)361件樣品，其中9件檢出單核細(xì)胞增生李斯特菌（生畜禽肉7件，速凍米面制品2件），陽(yáng)性率為2.49％。方法3檢測(cè)經(jīng)Opticon 2熒光定量PCR系統(tǒng)從LB₂增菌液篩選出11件陽(yáng)性樣品，將其分離科瑪嘉李斯特菌顯色平板，挑可疑菌落經(jīng)染色鏡檢、生化試驗(yàn)等證實(shí)為單核細(xì)胞增生李斯特菌陽(yáng)性的有10件（生畜禽肉8件，速凍米面制品2件），陽(yáng)性率為2.77％。

2.2 方法2與方法1比較

方法1檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌陽(yáng)性率為0.55%；方法2檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌陽(yáng)性率為2.49%。兩種方法均檢出陽(yáng)性樣品2件，兩種方法均為陰性的352件，方法2陽(yáng)性而方法1陰性的有7件，見(jiàn)表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，兩者陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ²=5.14，P<0.05)。以方法1為標(biāo)準(zhǔn)，方法2敏感度為100.00％（2/2），特異度為98.05％，假陰性率為0.00％，假陽(yáng)性率為1.95％。お

2.3 方法3與方法1比較

方法1檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌陽(yáng)性率為0.55%，方法3檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌陽(yáng)性率為2.77%。兩種方法均檢出陽(yáng)性的樣品有2件，兩種方法均為陰性的351件，方法3陽(yáng)性而方法1陰性的有8件，見(jiàn)表2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，兩者陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ²=6.13，P<0.05)。以方法1為標(biāo)準(zhǔn)，方法3敏感度為100.00％(2/2)，特異度為97.77％，假陰性率為0.00％，假陽(yáng)性率為2.23％。お

2.4 方法3與方法2比較

方法2檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌陽(yáng)性率為2.49%，方法3檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌陽(yáng)性率為2.77%。兩種方法均檢出陽(yáng)性樣品有9件，兩種方法均檢出陰性樣品有351件，方法3陽(yáng)性而方法2陰性的有1件，見(jiàn)表3。兩者陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.5)。 お

3 討論

單核細(xì)胞增生李斯特菌是一種重要的食源性致病菌，在國(guó)外食品中的污染率達(dá)5％～30％，感染后病死率高達(dá)30％～70%。在世界范圍內(nèi)確認(rèn)的爆發(fā)事件近20起，引起爆發(fā)的食物有蔬菜、奶酪、肉制品和熏制的海產(chǎn)品等。2008年8月加拿大發(fā)生李斯特菌食物中毒事件，污染源為楓葉公司生產(chǎn)的熟肉食品，造成10多人死亡。我國(guó)雖未有爆發(fā)性流行，但也加強(qiáng)了食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的污染調(diào)查，可是往往傳統(tǒng)的檢測(cè)手段耗時(shí)耗力、漏檢誤檢，造成陽(yáng)性率偏低。

本組資料中361件樣品選用3種檢驗(yàn)方法進(jìn)行平行檢測(cè)，相比之下國(guó)標(biāo)法（GB/T4789.31-2003）檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的陽(yáng)性率較低，其它2種方法有助于提高陽(yáng)性率。國(guó)標(biāo)法中MMA平板菌落形態(tài)視覺(jué)上很難辨別，且只能確定可疑菌落為李斯特菌屬,然后再通過(guò)一定的生化試驗(yàn)檢出單核細(xì)胞增生李斯特菌，而溶血試驗(yàn)的結(jié)果判讀受主觀因素影響較大。科瑪嘉李斯特菌顯色平板上雜菌少，單核細(xì)胞增生李斯特菌菌落為藍(lán)色帶白色暈圈，特征明顯，容易識(shí)別，很大程度上減少了人為影響。居建華等統(tǒng)計(jì)顯示，可疑菌落的確定概率>95%，是MMA平板的3倍多。生化鑒定時(shí)用APL listeria 10300生化鑒定試劑盒與傳統(tǒng)生化管相比，時(shí)間僅需1 d，也很容易掌握。PCR技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)相當(dāng)成熟，并且已應(yīng)用于單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)。方法1中的2件陽(yáng)性樣品和方法2中的9件陽(yáng)性樣品經(jīng)pticon 2熒光定量PCR系統(tǒng)篩選均為陽(yáng)性，用常規(guī)培養(yǎng)法驗(yàn)證，結(jié)果全都分離到單核細(xì)胞增生李斯特菌，方法3與方法2雖然在陽(yáng)性率上無(wú)差異，但提高了工作效率，表明PCR檢測(cè)方法快捷可靠。常規(guī)法檢測(cè)至少需要7 d，PCR法可在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)得出初篩結(jié)果，有利于食品污染的監(jiān)測(cè)和食物中毒事件的快速反應(yīng)。

方法3中經(jīng)PCR系統(tǒng)篩選陽(yáng)性的11件樣品，經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)鑒定有1件未檢出，分析原因有2種可能：①菌已死亡，因?yàn)镻CR檢測(cè)的是核酸而非活菌。②樣品中單核細(xì)胞增生李斯特菌含量很低，PCR方法靈敏度高能檢測(cè)到，而在平板上未能分離到。

實(shí)驗(yàn)證明，科瑪嘉李斯特菌顯色平板及PCR技術(shù)具有較高的靈敏度和特異度，較低的假陽(yáng)性率和假陰性率，無(wú)疑為準(zhǔn)確、快速檢測(cè)提供了新的選擇，特別是樣品量較大時(shí)，更加顯示其優(yōu)勢(shì)。對(duì)大量樣品進(jìn)行篩檢時(shí)，建議可以先多個(gè)樣品合并一組用PCR技術(shù)進(jìn)行初篩，結(jié)果陽(yáng)性者再對(duì)該組逐個(gè)作科瑪嘉李斯特菌顯色平板分離培養(yǎng)，挑可疑菌落接種純分離TSA-YE平板，再轉(zhuǎn)種SIM動(dòng)力管、點(diǎn)種血瓊脂平板，凡符合25℃時(shí)呈傘狀動(dòng)力、血平板上菌落有狹小透明溶血環(huán)者，用APL listeria 10300生化鑒定試劑盒作生化鑒定。這樣就縮短了檢驗(yàn)周期，提高了工作效率（減少了許多平板分離、形態(tài)識(shí)別及生化試驗(yàn)工作量），同時(shí)多種手段相結(jié)合，避免了漏檢、誤檢，提高了陽(yáng)性檢出率，能較快得出正確結(jié)果。

由于方法2與方法3中單核細(xì)胞增生李斯特菌陽(yáng)性檢出率比較接近，樣本量（361件樣品）又較小，難于對(duì)其檢測(cè)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，有待以后擴(kuò)大樣本含量作進(jìn)一步探討。お

4 參考文獻(xiàn)

［1］王捷.李斯特菌食物中毒.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，1999，26：550-552.

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［3］居建華，葉虹，顧偉忠，等.應(yīng)用不同培養(yǎng)基檢測(cè)單增李斯特菌結(jié)果比較.上海預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，20（1）：32-33.

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(收稿日期：2009-02-09)