副豬嗜血桿菌外膜蛋白P5基因的表達及表達產物的免疫原性分析

摘要:實驗通過將副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)外膜蛋白(Outer membrane protein，OMP)P5基因克隆至pET-28a(+)中，構建pET-OMP5原核表達質粒，再將其轉化至大腸桿菌Rosetta(DE3)，通過IPTG誘導重組菌，SDS-PAGE顯示pET-OMP5重組表達質粒在大腸桿菌中實現了高效表達，Western-blot表明融合蛋白能被陽性血清識別。昆明小鼠試驗結果表明OMP5重組蛋白具有一定的誘導免疫保護反應的能力。

關鍵詞:副豬嗜血桿菌;外膜蛋白;免疫原性

中圖分類號:S852.61+2文獻標識碼:A文章編號:1007-273X(2010)06-0008-02

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)屬于巴斯德菌科的革蘭氏陰性菌，可引起豬的Glasser病，其主要特征為纖維素性漿膜炎、關節炎和腦膜炎[1]。該病發病率高，已給養豬業造成巨大的經濟損失，目前預防該病的主要方法是注射滅活疫苗，但是由于HPS有15個血清型且20%以上分離株不可分型，各血清型間毒力差異較大，缺乏交叉保護[2]。已有報道指出其外膜蛋白(OMP)具有較強的免疫原性，可用于疫苗的研發[3-4]。

1材料與方法

1.1質粒與主要試劑

湖南HPS分離株5型SP株[5]、原核表達載體pET-28a(+)、pMD18T-OMP5質粒、大腸桿菌DH5α、Rosetta(DE3)為本實驗室保存;普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA Marker、Taq-plus酶、弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑均購自天根生化科技有限公司;雌性昆明小鼠購自湖南省疾病防控中心;中分子量預染蛋白Marker購自北京全式金生物技術有限公司;氫氧化鋁佐劑、HRP標記的兔抗鼠IgG購自Sigma公司;增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天為時代公司。

1.2OMP5基因原核表達載體的構建

將含有OMP5基因的陽性質粒pMD18T-OMP5和表達載體pET-28a(+)用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切處理，將OMP5酶切產物克隆至表達載體pET-28a(+)相應的酶切位點之間。參照文獻[6]篩選陽性克隆，并送上海英俊生物公司測序。陽性重組質粒命名為pET-OMP5。

1.3融合蛋白的誘導表達及鑒定

將陽性重組表達質粒轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態細胞菌，挑取單個菌落接種于含卡那霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養至OD600值約為0.6后，加1mmol/L IPTG振蕩誘導培養，將所獲得的菌液6 000r/min，4℃離心5min回收菌體，按文獻[6]進行SDS-PAGE電泳。pET-OMP5對應的表達產物命名為OMP5蛋白。

1.4pET-OMP5融合蛋白的Western-blot鑒定

將表達蛋白進行SDS-PAGE電泳。用半干式電轉移法將凝膠中的蛋白轉印至硝酸纖維素膜上。轉印好的硝酸纖維素膜用兔血清封閉，然后用HP陽性血清感作，PBST洗滌后加HRP標記的兔抗豬IgG抗體。漂洗后用增強型蛋白質顯色試劑盒按操作說明進行顯色反應。

1.5重組OMP蛋白包涵體的提取

誘導培養500mL pET-OMP5的轉化菌Rosetta(DE3)，離心收菌，超聲波裂解，參照文獻[7]的方法對包涵體進行提取，用SDS-PAGE對表達的OMP重組蛋白進行純度檢測。OMP重組蛋白的含量以Bradford檢測法采用分光光度計測定[7]。

1.6蛋白的免疫攻毒保護試驗

1.6.1OMP5蛋白3次免疫小鼠本實驗將OMP5蛋白分別與弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑分3次免疫昆明小鼠，免疫劑量為50μg/只，分為3組，每組10只4周齡雌性小鼠。第1組，對小鼠腹腔注射免疫OMP蛋白，第一次免疫使用弗氏完全佐劑;初次免疫后的14d和21d分別進行第2、3次加強免疫，使用弗氏不完全佐劑;第2組，對小鼠腹腔注射免疫Neu蛋白，初次免疫后的14d和21d分別進行第2、3次加強免疫，3次免疫都使用氫氧化鋁佐劑;第3組為對照組，小鼠未免疫任何蛋白。

1.6.2免疫老鼠攻毒試驗在第3次免疫的7d后，用致死量[8]對1.6.1中3組老鼠進行腹腔攻擊。接種后臨床連續觀察7d，比較試驗組及對照組老鼠死亡情況。

2結果

2.1pET-OMP5融合表達載體的構建及鑒定

通過軟件分析所測基因推導氨基酸序列結構，克隆的OMP5全基因長度為1 124bp，序列分析表明OMP5全基因ORF長度為1 104bp，推導氨基酸序列為368個aa，克隆的OMP5全基因序列與參照核苷酸序列(登陸號:NC-011852)的同源性為95%。將OMP5基因克隆pET-28a(+)中，再轉化DH5α菌，選取過夜培養后經PCR鑒定可得到1 104bp的目的條帶，符合預期大小條帶的菌落(見圖1)，表明目的基因已經克隆于表達載體中。

2.2pET-OMP5融合蛋白的SDS-PAGE鑒定及Western-blot分析

將含pETNeu質粒的陽性克隆的重組菌進行誘導表達，并經SDS-PAGE進行檢測分析，在誘導菌裂解液沉淀40KD處可見特異的蛋白質條帶，與預期蛋白的大小相一致(圖2)，Neu蛋白為包涵體表達。Western-blot分析表明重組蛋白Neu能與陽性血清中的抗體發生特異性抗原反應。

2.3昆明小鼠免疫攻毒保護實驗

第1組昆明小鼠死亡7只，保護率為30%;第2組昆明小鼠死亡9只，保護率為10%;第3組昆明小鼠死亡10只。

3討論

本實驗將HPS外膜蛋白P5基因克隆至原核表達載體pET-28a(+)中，在大腸桿菌Rosetta(DE3)中獲得高效表達。將重組蛋白免疫小鼠，結果顯示了小鼠在抵抗HPS進攻時獲得了一定的保護，證明了OMP5蛋白具有一定的免疫原性，為開發基因工程疫苗提供了理論依據。本實驗在免疫小鼠時使用了弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑，結果表明弗氏佐劑免疫效果明顯好于氫氧化鋁佐劑，即弗氏佐劑更能提高抗原的免疫原性。

參考文獻:

[1]NICOLET J. Haemophilus infection， In A. D. Leman，et al.(ed.)， Diseases of swine， 6th ed[M]. Iowa State University Press， Ames， Iowa，1986. 426-436.

[2]KIELSTEIN P，RAPP-GABRIELSON V J. Designation of 15 serovars of haemophilus parasuis on the basis of immunodiffusion using heat-stable antigen extracts[J]. Clin. Microbiol，1992，30:862-865.

[3]MINIATS O P，SMART N L，ROSENDAL S.Cross protection among Haemophilus parasuisstrains in immunized gnotobiotic pigs [J]. Can J Vet Res，1991，55:37-41.

[4]MARTIN DE LA FUENTE A J， RODRIGUEZ-FERRI E F， FRANDOLOSO R.Systemic antibody response in colostrum-deprived pigs experimentally infexted with Haemophilus paraduis [J].Research in Veterinary Science，2009，86:248-253.

[5]朱小寧，余興龍，李潤成，等.副豬嗜血桿菌的分離與鑒定及其16S rRNA生物信息學分析[J]. 湖南農業大學學報，2009，

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[6]J.薩姆布魯克，D W拉塞爾 著. 黃培堂 譯. 分子克隆實驗指南[M]. 第三版. 北京:科學出版社，2002.

[7]汪家政，范明.蛋白質技術手冊[M].北京:科學出版社，2000. 42-46.

[8]朱小寧，余興龍.副豬嗜血桿菌外膜蛋白D15基因的原核表達及其表達產物的免疫原性[J].中國獸醫科學，2010，40(2):158-163.