3個番茄品種及其6份親本材料指紋圖譜的構建

摘要：用CTAB法提取3個番茄品種及6份品種親本材料的DNA，通過AFLP-PCR分子標記方法，構建親本及品種的指紋圖譜。其結果利用如下：從分子水平構建了3個品種及其6份親本材料的指紋圖譜，6份親本材料擴增的多態性條帶從10～27條不等，平均17.56條，多態性位點比率為41.3％。通過符合率測定，親本純度符合率為100％，雜種一代為98.7％。利用Nei＆Li法計算番茄遺傳相似系數，3個品種及親本的遺傳相似系數分別于0.37～0.61和0.53～0.62，采用UPGMA法進行聚類分析，對3個番茄品種及其親本的遺傳關系進行分析，為番茄雜交育種提供理論參考。

關鍵詞：番茄品種；指紋圖譜：構建

番茄是世界重要的蔬菜作物之一。其品種較為繁雜。不同番茄品種區分較為困難，傳統的方法是通過表型特征判斷，耗時耗力。后來發展起來的通過同工酶和種子蛋白電泳技術進行鑒別，都存在或是受環境或是受發育階段等方面影響較大的缺點，而通過DNA指紋技術鑒定種子的真實性和純度基本不存在這方面的影響，因此通過DNA指紋技術建立品種和品系的指紋圖譜來保護品種和品系的真實性和純度較為準確，并具有重要的實際意義。本研究通過AFLP指紋技術建立了東農番茄3個品種及其親本品系的指紋圖譜，分析了各自的遺傳相似系數和樹狀圖，為培育出更多更好的番茄雜交品種打下了良好的基礎，為番茄的品種區分及純度鑒定，提供了重要的理論依據，同時為種子繁育及銷售作了良好的鋪墊。

1 材料與方法

1.1材料

試驗于2009年在東北農業大學番茄研究所進行，選取3個東農番茄品種及其親本，分別取其幼葉現取現用。供試品種及其親本來源見表1、表2。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取采用稍加改進的CTAB法。取0.2 g嫩葉放入1.5 mL的Eppendort管，液氮研磨，加入CTAB提取液，混勻后放人65℃水浴鍋中1h，期間不斷上下翻動，然后取出靜止10min；13000r·h^-1離心10 min，取上清液轉移到另1個干凈Eppendort管中，加入等體積氯仿異戊醇(24：1)抽提2次?；靹蚝笾糜冢?0℃冰箱內20 min：取出后13000 r·h^-1。離心10 min，倒掉上清液，沉淀DNA用80％酒精清洗2次，無菌條件下吹干，加300uL去離子水和4ul RNA酶，37℃水浴1h，取出加300 uL去離子水、600 uL氯仿異戊醇，混勻后靜止10min；13 000 r·h¹離心10 min，取上清液400 uL加入80 uL NaAc，搖勻，再加1 mL乙醇，在-20℃條件下保存20 min；取出后12 500 r·h¹離心10 min，倒掉上清液，用80％酒精洗2次，無菌條件下吹干，加入30uL去離子水溶解后于－20℃保存。提取的DNA質量通過分光光度計和1％瓊脂糖電泳檢測。

1.2.2 AFLP分析采用本實驗室所用的20對AFLP引物，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，如表3所示。

基因組DNA的雙酶切和連頭連接采用一步完成。其反應體系為：模板DNA 150 ng；EcoR I(10U·uL^-1)取0.5uL；Mse I(IOU·uL^-1)取0.5 txL；EcoR I adapter(5 pmol·uL^-1)取1.0uL；Mse I adapter(50pmoL·uL^-1)取1.0 uL；ATP(10 mmol·L-1)取1.0 ixL；10xBuffer取5.0 IxL；T4 DNA Ligase(5 U·uL^-1)取0.6uL；ddH20定容至50uL。37℃酶切與連接10 h。

預擴增體系：DNA(酶切連接后產物)取2uL，EcoR I-primer(E00 50 ng·uL^-1)取0.6 uL，Mse I—primer(MOO 50 ng·uL^-1)取0.6uL，10xBuffer取2uL，dNTP(2.5 mmol·L-1)取1.6 uL；MgCL²取1.2uL，Taq DNA polymerase(5 U·uL^-1)取0.2uL ddH²O定容至20uL。

預擴增程序：94℃3min；94℃30 s，56℃30s，72℃1min擴增24個循環：最后1個循環在72 cC保持10min，然后溫度降到4℃保存。

選擇性擴增的體系：預擴增產物稀釋25倍，加Exx、Mxx引物各1.0 txL，10xBuffer、dNTP(2.0 mmol·L-1)各2uL，MgCL²(25 mmol·L-1)1.2uL，Taq DNApolymerase(5 U·uL^-1)0.2uL，用ddH²O定容至20uL。

選擇性擴增的程序：94℃3 min；94 ℃30 s，65℃30 s，72℃1min擴增12個循環；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min擴增25個循環：然后在72℃保持10 min，最后溫度降到4℃保存。

PCR產物經1％瓊脂糖預檢測后，用6％聚丙烯酰胺變性膠電泳，80 W預電泳0.5 h，75 W電泳1.5 h，電泳結束后，銀染檢測。干膠后拍照。

1.3 數據分析

DNA指紋分析結果采用二元性編碼，即某一條帶的有無2種狀態，用1表示帶(片段)存在，用0表示帶(片段)不存在，得到二元數據組成矩陣，然后用NTSYSpc2.11a軟件進行遺傳相似系數計算，構建其聚類分析樹狀圖。

1.4 純度鑒定方法

通過人工育苗，選取品種及親本每份材料壯苗各120株，在2葉1心時提取DNA做AFLP分析，調查種子純度。苗期于田間隨機抽查6份親本材料各100株，3份雜交一代各100株，加以標記，室內提取葉片DNA做AFLP分析，并與田間調查結合作出結論。

2 結果與分析

2.1 6份親本材料的AFLP多樣性檢測

隨機選取20對AFLP引物，分別對6份材料的DNA進行AFLP-PCR分析，篩選出了9對擴增產物多態性好、譜帶清晰的AFLP引物，其引物組合如表4。利用篩選出的9對引物對表1中的6份親本材料的基因組DNA進行了AFLP分析。6份材料共擴增出383條帶。其中158條帶具有多態性，總平均多態性比率達41.3％：每對引物組合平均檢出多態性條帶為17.56條，多態性比率在22.2％-63.0％。

2.2 3個番茄品種及其親本AFLP遺傳相似系數

利用NTSYS2.1la分析軟件，采用簡單匹配系數計算3個品種及其親本品系的遺傳距離相似系數，如表5、表6所示。表中數據采用的是Nei-Li系數的SM方法計算出的遺傳相似系數，可知6份親本材料的遺傳相似系數在0.37-0.61，遺傳背景比較狹窄，說明品種親本之間有比較近的親緣關系，這對于培育優質番茄品種不是很有利。3份品種材料的遺傳相似系數在0.53-0.62，平均遺傳相似系數為0.56。品種親本的遺傳相似系數平均為0.52，而品種為0.56，基本一致，其差異之處可能有2種原因：一是不同品種親本之間表現出差異性，而品種之間并無差異性：二是親本遺傳時由于某些原因造成了一些位點的缺失，使得品種間存在差異，具體原因需要進一步研究確定。

2.3 3個番茄品種及其親本AFLP聚類圖

采用非加權配對算術平均數法對番茄3個品種親本品系及品種做聚類分析，建立聚類樹狀圖(圖1、圖2)。由聚類分析結果可以看出，在相似系數0.57處，6份親本材料被劃分為2個類群和1個特殊類群：第1類包括3個，即07925、0912F和T512；第2類包括2個，即0912M和T511：還有1個特殊類群08576。在相似系數0.60處，3份品種材料被劃分為2個類群，712和713聚為1類，708單獨成為1類。

2.4 6份番茄親本材料和3個品種DNA指紋圖譜的構建

利用篩選出的9對AFLP引物構建親本材料和品種的AFLP指紋圖譜，其構建的模式指紋圖譜見表7、8，其中“+”表示該片段處有帶，“－”表示該片段處無帶，空白表示該處帶缺失。

2.5 9份材料純度鑒定

2.5.1 生產用種的快速鑒定AFLP分子檢測發現6份生產用親本材料無一雜株，300份生產用雜交一代種混有2株保持系。分析結果顯示6份親本純度達100％，雜交一代純度達98.7％。

2.5.2 分子檢測與田間純度調查苗期時，隨機采取田間6份親本單株葉片各100份，雜交一代單株葉片各100份，提取總DNA，AFLP分子檢測雜交一代種混有1株雜株，6份親本中未發現雜株。果期時，對植株及果實進行調查，發現6份親本材料的表型特征完全符合材料的標準表型特征，而其雜交一代的表型特征有1％不符合。親本及品種的形態學鑒定與分子鑒定結果基本一致，可見AFLP技術用于種子純度鑒定是可行的。

3 討論

欒雨時等嘲用放射性同位素Y-³²P-ATP標記人工合成的簡單重復序列(GATA)。與經Dra I酶切的8個番茄品種的DNA進行Southern雜交，用SSR方法得到了DNA指紋在品種間差異很大，在品種內單株間無差異的結論。在本研究中，曾經用SSR方法擴增出的材料條帶之間無太大的區別，這可能有兩方面的原因，一方面實驗中所采用利用SSR引物直接進行材料DNA擴增：另一方面是番茄品種為栽培品種或者親緣關系較近，有待于進一步驗證。宋健等m利用SSR分子標記分析番茄的遺傳多樣性，得出野生番茄親緣關系較遠，栽培番茄親緣關系較近的結論。本研究中，親本的遺傳相似系數在0.37～0.61，品種的在0.53-0.62，遺傳相似系數比較近，由于品種及品種親本均為栽培種，這與宋健等人所得的結論是一致的。

孫德嶺等用AFLP標記了白菜類蔬菜，通過聚類分析證明了AFLP技術用于白菜類蔬菜親緣關系鑒定的可行性。本實驗首次采用AFLP方法標記了番茄品種及其親本，建立了指紋圖譜，通過指紋圖譜發現親本及其品種擴增后的條帶基本一致，再者通過聚類分析發現品種712和713聚在一起，而兩者的親本也是交叉聚在一起，708單獨列為1類，其2個親本也是單獨成類，親本和品種的聚類結果是一致的?？梢?，采用AFLP方法構建番茄品種指紋圖譜是可行的。

明軍利用AFLP分子標記方法對梅花一些主要品種進行了指紋圖譜的構建，賈曉燕㈣用SSR和AFLP方法構建了河北省大豆一些推廣品種的指紋圖譜，并對其遺傳多樣性進行了分析，但這些利用分子標記構建指紋圖譜的研究基本上都停留在單獨對品種或是單獨對品系的構建上。本研究同時構建了品種和其親本各自的指紋圖譜，這對于保護品種、品種來源及各自的純度有很重要的意義，并且為番茄雜交育種親本的選配提供了理論依據，可更好的指導番茄雜交育種研究。

4 結論

從20對AFLP引物中篩選到9對重復性好、多態性豐富的AFLP引物，利用這9對引物組合可以準確鑒別3個品種及6份品種親本材料。建立了9份材料的DNA指紋圖譜。同時根據指紋圖譜分析了材料的遺傳相似系數，親本在0.37-0.61，品種在0.53-0.62。通過聚類圖分析了親本的遺傳關系，這些結論的得出為番茄的品種區分及純度鑒定，提供了重要的理論依據，同時為種子繁育及銷售作了良好的鋪墊。