黃瓜CMV復制酶基因相對表達定量PCR方法的建立

摘要：為了對黃瓜感染CMV植株體內CMV復制酶基因表達水平進行測定，建立CMV復制酶基因的相對表達定量檢測技術。并用該方法開展黃瓜植株CMV抗性鑒定試驗，以18S rRNA基因為對照。CMV復制酶基因為目標基因，設計引物，探索SYBR Green實時熒光定量PCR反應體系，同時對CMV復制酶基因進行均一化處理，利用熒光閾值(O值)計算p－防御素基因的相對表達量。結果表明：利用SYBR Green I實時熒光定量PCR技術測定黃瓜CMV復制酶基因相對表達定量具有較高的準確性，耗時短，該技術可應用于CMV抗性植株的篩選。

關鍵詞：實時熒光定量PCR；CMV復制酶基因；相對表達量；黃瓜

黃瓜花葉病毒(Cucumeer，mosaic virus，CMV)在分類上屬于雀麥花葉病毒科(Bromoviridate)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)，是黃瓜病毒病的主要毒源。它的寄主范圍很廣，能浸染85科365屬的1000多種單雙子葉植物，主要依靠蚜蟲傳毒。目前通過采用常規化學藥劑防治病毒病效果不明顯，因此，培育抗病毒病品種是一種十分有效的防治途徑。傳統育種在抗病性轉育過程中，需要在人工接種后，根據表型用目測法進行抗病性鑒定，不但費時、費力、轉育效率低，而且存在因鑒定的誤差容易使目標性狀丟失等問題。因此，建立CMV復制酶基因相對表達量的測定方法，以便高效快捷篩選出抗性目標植株。同時對研究抗性分子學機理也是非常必要的。

實時熒光定量PCR是最近幾年發展起來的新技術，是在常規PCR基礎上把熒光共振能量轉移與熒光標記探針結合，巧妙地把核酸擴增、雜交、光譜分析和實時檢測技術融合在一起的一項創造性技術，具有準確、簡便、高靈敏度等特點，特別是定量低豐度的mRNA及揭示微小的基因表達變化。該技術不要求擴增后電泳等的處理，可以節省時間，并能有效消除實驗室PCR產物如核酸和溴化乙錠等污染。實時熒光定量PCR技術現已廣泛應用于生物學、基礎醫學、法醫學、診斷學等多個領域。

本研究方法以SYBR Green I實時定量PCR為基礎，采用相對標準曲線法檢測CMV復制酶基因相對表達量，建立黃瓜CMV復制酶基因相對表達定量檢測技術體系，并應用于黃瓜CMV抗性植株的篩選，為進一步進行黃瓜抗病育種研究奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 接種病毒來源及植物試驗材料

接種采用的CMV為黃瓜花葉病毒植物凍干粉，購自福建農林大學植物病毒所福州騰龍生物有限公司。取所購CMV植物凍干粉0.5 g加10 mL0.03 mol·L^-1磷酸緩沖液(pH值=7.0)勻漿，置于冰上待用。植物材料選用感CMV的黃瓜材料HZL04-1，抗CMV的黃瓜材料F-3，及其F2代群體，培養于光照培養箱(20-25℃)中，以最終獲得的189個F2代單株作為試驗材料。

1.2 接種方法

待黃瓜葉片長至2片真葉時，用清水將葉子清洗干凈，待水干后均勻撒上少量石英砂，采用摩擦接種方法專人接種CMV。接種1min后用清水輕輕沖洗葉片。3 d后再接種1次。本研究共處理了189份樣品用于后續試驗。

1.3 黃瓜基因組總RNA的制備

分別取接種前和感染CMV后的黃瓜葉片提取總RNA，采用RNA prep植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)，按照試劑盒內說明書操作。

1.4 PCR引物的設計與合成

以煙草18S rRNA為內參基因，以CMV復制酶基因為目標基因，使用Primer Express 3.0軟件設計2對引物，序列見表1。引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.5 cDNA反轉錄

cDNA反轉錄采用隨機引物進行。PCR反應體系(20uL)如下：RNA 2.0uL；first-strand buffer(5*)4.0uL；dNTP(2.5 mmol·L^-1)2.0uL；隨機引物(10uM)2.0uL；Rnasin(40 U·uL-1)0.5 uL；M-MLV(200U·uL-1)1.0uL。

1.6 實時熒光定量PCR反應

以反轉錄合成的cDNA為模板同時對目的基因(CMV復制酶基因)和內參基因(18S rRNA)熒光定量PCR擴增。PCR反應體系為20 uL，其中2倍的SYBR Green Master Mix(ABI)10uL，正向引物和反向引物(10umol·L^-1)0.4uL，cDNA模板1uL，用滅菌去離子水補至20uL。

實時熒光定量PCR在Step One Plus(ABI)熒光定量PCR儀上進行。反應程序為95℃10min；95℃15 s，60℃1 min，40個循環。融解曲線程序為：95 ℃15 s，60℃1 min；60-90℃(每0，3℃讀1次信號)：90℃15 s。

2 結果與分析

2.1 SYBRGreen法定量PCR檢測黃瓜內參和目標基因

以cDNA為模板，用表1中18S引物和CMV引物對樣品進行實時熒光定量PCR擴增(圖1)。結果顯示，參照基因和目標基因都能得到良好的擴增，其中參照基因、目標基因Ct值(圖lA)分別為：熔解曲線為單峰，基線較為平整，Tm值(圖1B)分別為78.51、75.55℃；取擴增產物10 uL，100 V經瓊脂糖凝膠電泳40min，結果(圖1C)顯示，參照基因和目標基因都擴增得到預想的片段大小，沒有嚴重的引物二聚體產生。

圖1A.擴增曲線圖：圖1B.熔解曲線圖：圖1C.PCR產物電泳圖。

M.DL2000 DNA Marker；1.內參基因空白對照：2.目標基因空白對照；3.內參基因；4.目標基因。

2.2 相對標準曲線的繪制

將1號樣品cDNA模板以100、20、4、0.8倍稀釋4個梯度，進行實時熒光定量PCR，建立標準曲線(圖2)。內參基因的R2=0.983；目標基因的R2=0.992，反應效率都高于0.98，且二者反應效率接近，說明該體系可以用于熒光定量PCR體系。

圖2A.內參梯度擴增曲線：圖2B.內參標準曲線：圖2C.目標梯度擴增曲線；圖2D.目標標準曲線。

2.3 利用相對標準曲線檢測189個樣品目標基因表達量

以1號樣品為參照，用上述方法檢測189個處理樣品的CMV復制酶基因相對表達量，并以此為依據，篩選抗病植株。在檢測樣品中，R0<10¹的樣品數12個，101≤RQ<103的樣品數26個，10³≤RO<104樣品數49個，10⁴≤RO<10⁵樣品數81個，10⁵≤RQ<10⁶樣品數21個(圖3A)。圖3B顯示部分定量結果，RO范圍從1～80000。

2.4 實時熒光定量PCR檢測方法準確性檢驗

為了驗證本檢測方法的準確性，將試驗檢測結果與同時采用ELISA方法檢測CMV抗性的結果進行比對。結果表明：單株編號為3、4、7、16、42、43、50、51、55、57、65、67、69、78、86、93、99、107、115、130、135和168，共22株的CMV復制酶基因的相對表達量非常少，表現為抗性，2種檢測方法結果一致(表3)。說明本研究建立的方法能夠用于CMV抗性的篩選。

3 討論與結論

實時熒光定量RT-PCR能夠在PCR反應過程中根據檢測到的熒光量變化實時地檢測記錄PCR擴增產物的增加，有效克服了終點法定量PCR產物的不足，使準確定量RNA、DNA成為現實。采用實時RT-PCR技術相對定量基因表達，關鍵一步就是標準曲線的制作。制作精確的標準曲線可以獲得標準曲線的斜率，計算擴增效率，從而可以排除PCR擴增效率對計算結果的影響，更加準確地計算出基因的相對表達量。

本研究利用實時定量RT-PCR對黃瓜植株組織內CMV復制酶基因相對表達水平進行了測定，結果顯示，CMV復制酶基因在黃瓜感病植株組織中相對表達水平大大高于黃瓜抗病植株組織中的相對表達水平。本試驗利用實時熒光定量RT-PCR檢測的結果與采用ELISA方法檢測CMV抗性的結果基本一致。因此，利用SYBR Green I實時定量RT—PCR技術可以測定黃瓜植株體內黃瓜CMV復制酶基因表達水平的相對變化。