西瓜高效再生體系的建立

摘要：以優質小果型西瓜品種西173和小麒麟為材料，系統研究了以子葉為外植體的西瓜組培高效再生體系。結果表明：2個西瓜品種在不定芽和愈傷組織誘導上存在著較大差異，在MS+6-BA 1.0mg·L-t+IBA0.5mg·L^-1的分化培養基上，西173不定芽誘導率最高達到92.6％，在MS+6-BA 2.0mg-L^-1+IAA 0.2mg·L^-1培養基上小麒麟不定芽誘導率最高達到89.7％；誘導出的不定芽叢伸長以MS+KT0.2mg·L^-1培養基最佳；2個西瓜品種不定芽在MS+IBA0.2 mg·L^-1，培養基上均獲得了較好的生根效果。組培苗移栽后保持高溫、高濕是移栽成活的重要條件。西瓜高效再生體系的建立為應用基因工程技術改良西瓜品質和提高其抗逆、抗病性奠定了基礎。

關鍵詞：西瓜；子葉；不定芽；植株再生

西瓜(CucumIS L.)是具有重要經濟價值的世界性水果，在我國具有悠久的栽培歷史，我國是世界第1西瓜種植大國。西瓜含有果糖、蔗糖、葡萄糖以及維生素、蘋果酸、鈣、磷、鐵等營養成分，富含15種氨基酸、酯酶、多酚氧化酶、果膠酶、纖維素酶等多種活性物質。西瓜具有止渴生津、清熱消暑、利尿解毒等功效，食用價值高，深受廣大消費者青睞。近年來，隨著植物基因工程技術的迅速發展，采用轉基因技術將目的基因導入西瓜已成為可能，對于開展西瓜轉基因研究創造新的種質資源，特別是提高西瓜抗病性、抗逆性和改良西瓜品質提供了快捷可行的新途徑。西瓜高效再生體系的建立則是西瓜轉基因技術中最基礎性的工作。

在西瓜組織培養植株再生方面，目前已能夠通過子葉、下胚軸、真葉等外植體再生出完整植株。但是不同西瓜品種的組培再生潛力依基因型表現出明顯不同。另外，培養基種類、植物激素種類及其組合配比在不同的研究報道中，其組培再生能力不盡相符。為此，本研究以優質小果型西瓜品種西173和小麒麟為材料。系統研究了西瓜再生體系，目的是篩選出適合其組培再生的最佳培養基配方，為應用轉基因技術改良西瓜品質和增強其抗病、抗逆性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試品種和外植體

供試的西173和小麒麟為小果型西瓜，均為山東省農業科學院蔬菜研究所選育的優良品種，采用的外植體為西瓜莖尖、子葉切塊(分近胚軸端、遠胚軸端)、整片子葉、莖段、真葉和下胚軸。

1.2 培養基與激素

以MS為基本培養基，激素種類包括6－BA、IAA、NAA、GA3、IBA和KT，配成100 mg·L^-1母液于4℃冰箱中保存。設計不同激素質量濃度配比，篩選最佳愈傷組織與不定芽誘導培養基、不定芽伸長培養基和誘導生根培養基配方。

1.3 試驗方法

1.3.1 西瓜無菌苗的獲得西瓜種子除去外殼，在超凈工作臺上用0.1％HgCI(升汞)表面殺菌消毒15min左右，無菌水沖洗4-5次后播種于MS基本培養基上萌發。

1.3.2 誘導不定芽分化切取苗齡4-5 d的西瓜無菌苗子葉，將近胚軸端切去1-2mm再橫切為2段：下胚軸切成0.5 cm長，無菌苗莖尖、莖段切成0.2cm長，真葉切成0.5 cmx0.5 cm大小。將外植體接種到愈傷組織和不定芽誘導培養基上，每瓶接種30塊。置于光照培養箱培養。培養溫度(28+2)℃，光周期為每天16 h光照／8 h黑暗，光照度3 000lx。

1.3.3 誘導不定芽伸長和生根外植體上的芽叢長至0.5-1cm時，將叢生或單生不定芽切下，接種到不定芽生長培養基上，待其長到2 cm左右時，從基部切下，轉接到生根培養基上誘導其生根。

1.3.4 再生植株移栽 待不定芽長出一定量的根后，去掉封口膜煉苗3-5 d，將組培苗從培養瓶中取出，洗去根上附著瓊脂，移栽到預先高壓滅菌的蛭石和草炭土(1：1，V／V)基質中，溫室同常規管理。

1.4 統計方法

4周后統計發生不定芽的外植體數目和愈傷組織發生情況，以篩選出不定芽誘導最佳激素組合和最適宜苗齡。

誘導率(％)=產生不定芽外植體數，接種外植體總數x100平均出芽數(個)=全部外植體總芽數，接種外植體總數

2 結果與分析

2.1 不定芽的誘導

2.1.1 不同質量濃度6-BA處理對叢生芽的影響有關西瓜再生資料表明，6-BA是西瓜外植體分化的關鍵激素。將生長在MS培養基中苗齡5 d的無菌苗子葉切成段，除去兩端，在超凈工作臺上將2片子葉分開，切取近胚軸端接種于不定芽誘導培養基上培養，以MS為基本培養基，6-BA設置0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg·L^-1 8個處理，依次編號為M1-M8。每個處理設3次重復，每個重復接種外植體30塊左右，培養4周左右統計叢生芽誘導率，結果見圖1。

試驗結果表明，在不含6-BA的M1培養基上，子葉切塊基部長出許多不定根且無不定芽的分化，說明6-BA對誘導胚性愈傷組織和不定芽分化是必需的。而當激素濃度過高時，產生的叢生芽數量相對較少而愈傷組織疏松質軟，呈淡黃色。6-BA質量濃度0.5-2.0 mg·L^-1(M2～M5)時，2個西瓜品種均可獲得較高的誘導率，最高接近80％(圖1)，同時形成綠色、致密緊湊成瘤狀的愈傷組織，這樣的愈傷組織最終才能分化出叢生芽。

2.1.2 外植體部位對不定芽誘導率的影響 為了探-討最適宜的誘導不定芽的外植體，筆者以MS+6-BA1.5 mg·L^-1，為誘導培養基分析不同部位外植體的誘導率。結果表明，莖尖與子葉切塊(近胚軸端)不定芽誘導率均較高。西173和小麒麟的莖尖誘導率分別達到94.4％和91.3％，平均出芽數分別為7.6和6.1個；而西瓜子葉切塊(近胚軸端)誘導率分別達到78.6％和80.5％，平均出芽數分別為5.6和5.9個，是較為合適的外植體。整片子葉誘導率為46.9％和51.9％，而子葉切塊(遠胚軸端)和下胚軸誘導不定芽分化率很低，莖段、真葉基本不能誘導出不定芽。詳見表1。

莖尖和子葉切塊(近胚軸端)均可誘導形成良好的不定芽叢。由于莖尖產生頂芽對已分化的不定芽生長具有一定的抑制作用，并且莖尖太小，組培試驗中不易操作：而近胚軸端子葉切塊在組培試驗中易于操作，且不定芽誘導率也高，所以近胚軸端的子葉段是不定芽誘導最佳外植體。完整子葉接種后過度膨大，且西瓜再生的不定芽玻璃化現象較為嚴重，成活率低。此外，還發現子葉不同部位誘導不定芽的難易程度不同，絕大多數叢生不定芽是由子葉基部產生的，子葉邊緣和中間誘導分化的不定芽極少。莖段和真葉接種后大多數產生松散的淡黃色愈傷組織，隨著繼代培養逐漸褐化、枯萎而死亡，難以誘導出不定芽。

2.1.3 不同苗齡子葉外植體對誘導芽叢的影響將2個西瓜品種不同苗齡無菌苗子葉按1～7 d切割得到的外植體接種于MS+6-BA 1.5 mg，L^-1不定芽誘導培養基上培養30 d左右，統計不定芽誘導率，

從圖2可以看出，西瓜苗齡3-5 d子葉不定芽誘導率維持在較高水平，此時正是子葉顏色由淡黃色轉為淡淺綠色時期，隨著子葉顏色加深誘導率下降。依據子葉塊顏色變化作為外植體切塊的一項重要參考指標，可獲得較高的不定芽誘導率。

2.1.4不同激素及質量濃度配比對不定芽誘導率的影響 為了獲得較高不定芽誘導率，將2個西瓜品種子葉切塊，分別接種于不同激素組合配比誘導培養基上篩選西瓜高效誘導培養基的激素組合。在試驗中共設計了12種以MS為基本培養基，添加不同激素組合的誘導培養基類型。由表2可見，西173在MS6培養基上誘導率最高，達到92.6％，平均出芽數達8.2個：而小麒麟則在MS7上獲得的誘導率最高，達89.7％。平均出芽數為6.2個。6-BA質量濃度維持在1.0-2.0mg·L^-1時，誘導率均較高，平均出芽數也較高，隨著6-BA質量濃度加大到3.0 mg，L^-1，不定芽誘導率明顯下降，且不定芽玻璃化程度加重，產生的不定芽弱而小。加入低質量濃度的IAA或IBA，對西瓜不定芽誘導有一定促進作用。NAA對西瓜不定芽分化具有明顯的抑制作用，使西瓜子葉塊誘導率顯著下降。由表2可以看出，西173和小麒麟子葉切塊最佳不定芽誘導培養基分別為MS6和MS7。

2.2 不同激素及其質量濃度配比對不定芽生長的影響

將誘導產生的形態正常的不定芽叢移人添加不同激素組合的不定芽生長培養基中，以確定不定芽伸長的最佳激素配比組合，結果見表3。

西瓜不定芽轉接到新鮮的MS+KT 0.2 mg·L^-1。培養基上即可獲得很好的伸長效果，添加少量質量濃度的IAA、IBA、GA在一定程度上會加重不定芽的玻璃化現象，添加少量的NAA則會使不定芽長出無根毛的不定根，移栽后組培苗很難成活。

2.3 不同激素及其質量濃度配比對不定芽生根的影響

叢生不定芽伸長至2～4 cm即可分株，移人生根培養基進行生根培養。2個西瓜品種再生植株均較易生根，采用MS為基本培養基，添加0.2 mg·L^-1的IBA或IAA皆可誘導出形態正常、有明顯根毛的不定根。隨著IBA或IAA質量濃度的升高，不定芽莖叢基部易形成新的愈傷組織，且誘導出的不定根短而粗，根毛極少，不利于再生苗移栽成活。由于IBA價格便宜，且可直接加入到培養基中高壓滅菌，故在西瓜再生植株生根過程中以采用MS+IBA 0.2 mg·L^-1培養基較為理想。

2.4 再生苗移栽

西瓜再生組培苗移栽較難成活，經過多次試驗發現，西瓜再生植株移栽后保持高溫、高濕是移栽成活的關鍵。組培苗煉苗后，小心除去瓊脂，盡量不傷害根毛，除去部分葉片。移入經高壓滅菌的由蛭石和草炭土混合而成的基質中，混合體積比為1：1。移栽后保持較高濕度，用遮陽網遮陰3 d后，逐漸增加見光時間，1周后可常規管理。

3 討論與結論

激素6-BA是葫蘆科植物組培外植體誘導不定芽分化的關鍵激素，這在甜瓜、黃瓜、西葫蘆、南瓜、苦瓜等作物組培再生中得到試驗證實。不同西瓜品種由于基因型不同對激素的敏感程度也不同，這是組培再生試驗操作重復性差的主要原因，一定質量濃度的6-BA是誘導西瓜外植體分化所必須的激素，附加低濃度的IBA或IAA則有利于西瓜外植體不定芽分化的發生，不同基因型的西瓜不定芽誘導率存在一定差異。確立西瓜最佳誘導條件，尤其是植物激素質量濃度及組合配比，是西瓜獲得高效組織培養的先決條件之一。

本試驗結果表明，西瓜西173和小麒麟的適宜誘導培養基分別是MS+6-BA 1.0 mg·L^-1+IBA 0.5mg·L^-1和MS+6-BA 2.0 mg·L^-1+IAA 0.2 mg·L^-1，試驗中還發現，在西瓜組織培養過程中出現極性現象，即西瓜子葉近軸端和遠軸端在誘導過程中的表現不同，不定芽總是在近軸端切口部位產生，發生這種現象的原因可能是由于植物激素在外植體中發生極性運輸所致：不同基因型植物對細胞分裂素與生長素種類的敏感性差異明顯，因此激素種類的選擇應以植物材料的基因型而定。苗齡對于外植體的分化有較大影響，當西瓜子葉顏色由淡黃色轉淡綠色時切割子葉塊種植外植體，可獲得較高的再生頻率。西瓜再生苗移栽較難成活，高溫、高濕是移栽成活的重要因素，移栽時采取遮陰措施能夠提高西瓜再生組培苗成活率。