春蘿卜雄性不育系4—05A減數分裂及雄配子體敗育過程觀察

摘要：從形態學和細胞學基礎方向研究了春蘿h不育系4—05A，以保持系4—05B為對比。觀察并測量花器官雌雄蕊形態，確認4—05A比4—05B的花長勢弱，雄蕊花藥外形小、中空無花粉，雌蕊花柱較長。采用花粉壓片法觀察小孢子母細胞減數分裂及雄配子體發育過程，證明該不育系材料為花粉敗育型。不育系4—05A的小孢子母細胞能正常進行減數分裂并形成單核花粉。但雄配子體進一步發育過程中。在單核中期到靠邊期的發育階段小孢子發生敗育，不能形成可育的成熟花粉粒。減數分裂胞質分裂方式為同時型。

關鍵詞：春蘿卜；雄性不育系；4—05A；減數分裂；雄配子體；敗育

蘿卜(Raphanus sativus L.)是一種原產于我國的重要世界性蔬菜，其雜種優勢明顯。雄性不育性是作物雜種優勢利用的重要手段，自1968年Ogura在日本鹿兒島首次發現蘿卜雄性不育株育成不育系，我國學者也對其不育性遺傳機制進行了研究并轉育應用。目前，利用雄性不育系配制生產的蘿卜一代雜種已在全國各地廣泛推廣。春蘿卜雄性不育系4-05A及其保持系4-05B是由山西省農業科學院蔬菜研究所蘿卜遺傳育種課題組選育的優良不育系，目前已在生產上應用配制雜交種。由于植物雄性不育花藥敗育時期和方式多樣，為深入了解春蘿卜雄性不育系4-05A的花藥敗育途徑，本研究對該雄性不育系的花器官形態、小孢子母細胞減數分裂過程及其雄配子體發育和敗育時期進行了觀察和比較，以便為其雄性不育的遺傳規律和性狀調控研究提供理論依據，更好地利用這一育種途徑。

1 材料與方法

1.1材料

春蘿卜雄性不育系4-05A及其相應的保持系4-05B供試材料由山西省農業科學院蔬菜研究所蘿卜育種課題組提供。

1.2方法

1.2.1 田間試驗為保證蘿卜雄性不育系種子純度和質量，采用溫室隔離種植及大株采種。2008年春季將前1年收獲的春蘿卜雄性不育系4-05A及其相應保持系4-05B的越冬種蘿卜種植于山西省農業科學院蔬菜研究所日光溫室，并采取隔離種植措施。花期人工授粉，將保持系花粉授給不育系從而收獲種子。

1.2.2不育系及其相應保持系雌雄蕊形態解剖測量 在盛花期分別隨機取20朵不育系和保持系當天開放的花，在體視顯微鏡下解剖觀察，測量其四強及二弱雄蕊的長、寬度和柱頭高出四強雄蕊的長度，然后求其平均數及標準差。

1.2.3 小孢子母細胞減數分裂過程及雄配子體發育觀察根據經驗。蘿.花序在晴天10：00-11：00細胞分裂最旺盛，摘取未開花的完全花序固定于卡諾固定液(V無水乙醇：V冰醋酸=3：1)24 h，經95％、85％乙醇洗滌各20 min后轉入70％乙醇中，于4℃冰箱保存備用。制片時從花序上挑取一定大小的單個小花苞，解剖鏡下剝出花藥。本品種花蕾直徑1-1.5 mm時小孢子母細胞發育為減數分裂期，其他花粉發育時期可根據花蕾直徑大小推測，一般同一花序并不能包括全部發育時期，需多取樣尋找，同時也獲得試驗重復，每個發育關鍵時期均觀察制片10片以上。采用改良卡寶品紅并輔助使用醋酸洋紅染色液染色及花粉壓片法，Olympus vanox顯微鏡下觀察并照相。

2 結果與分析

2.1不育系4-05A的雌雄蕊形態

據開花期田間觀察，不育系4-05A比保持系4-05B的花長勢弱(圖1)，花冠偏小，花藥瘦癟，藥壁呈半透明膜狀，藥內中空，花藥不開裂，或后期干枯開裂也無花粉：而4-05B花藥飽滿，藥室分隔明顯，每個藥室內可見黃色花粉，開花干燥后沿藥隔縫開裂散粉。測量雌雄蕊長度(表1)可知，4-05A和4-05B都是二弱雄蕊比四強雄蕊的花藥稍大，主要表現在花藥長度上。4-05A比4-05B的花藥長度及寬度都明顯小，說明4-05A雄性不育性能不僅表現為花粉敗育，而且也對整個花器官發育有負影響，尤其是雄蕊花藥外形減小，四強和二弱雄蕊表現一致。但4-05A比4-05B的雌蕊卻長勢強，從柱頭高出四強雄蕊的長度測量平均值可明顯看出，4-05A柱頭高度是4-05B的1.7倍，說明不育系雌蕊發育受雄性敗育的影響小。不育系比保持系的雌蕊花柱較長在其他作物上也有類似情況，柱頭伸出較長有利于接受外源花粉。

2.2不育系4-05A小孢子發生及雄配子體敗育過程

花粉壓片觀察結果證明不育系4-05A在小孢子發生時期正常，小孢子母細胞通過減數分裂形成四分體，四分孢子分開釋放出染色體數減半的小孢子形成單核花粉，即雄配子體。雄配子體進一步發育，小孢子花粉從單核中期到單核靠邊期的發育過程中出現異常。有的小孢子能達到單核靠邊期，但未見能形成二細胞花粉，最終敗育。

2.2.1小孢子母細胞減數分裂過程 當花序中心花苞長到直徑1～1.5 mm時，花藥發育一般為小孢子母細胞減數分裂期。此時，小孢子母細胞體積大并相互連接，較難從藥囊中擠壓出。減數分裂細線期：染色體很細并交織成網狀，核仁明顯(圖2，1)；偶線期：染色體聯會配對，但仍為較長的細線，無法辨認染色單體(圖2，2)；粗線期：染色體線性化明顯，向四周發散，局部區域相互盤繞(圖2，3)；雙線期：染色體進一步螺旋化，染色單體相互交叉形成“X”型交叉結(圖2，4)；終變期：染色體超螺旋化，可清楚地觀察到環狀或棒狀二價體(圖2，5和6)；中期I：18個二價體整齊排列在赤道板上，側面觀可見染色體受到紡錘絲牽引整齊地排列在赤道板上(圖2，7)，極面觀可見9對染色體散布在細胞中，兩兩配對(圖2，8)，此時為染色體記數的最佳時期：后期I：同源染色體分離(圖2，9)，受紡錘絲牽引均等地向細胞兩極移動，使染色體數目減半：末期I：染色體到達細胞兩極，仍保持高度濃縮的超螺旋狀態，未見核膜、核仁出現，細胞質也不分裂(圖2，10)；沒有間期，染色體直接進入第2次分裂的前期Ⅱ(圖2，10)；中期Ⅱ：2組染色體分別排列在各自的赤道板上(圖2，11)：后期Ⅱ：姐妹染色單體分離，移向兩極：末期Ⅱ：細胞中形成四堆染色體，呈對稱型(圖2，12)或非對稱型(圖2，13)2種形態，核膜、核仁重新形成，胞質同時四均等分裂并生成細胞板，最終形成4個含有單倍染色體組的子細胞：四分孢子期：4個子細胞被胼胝質包被，排列方式有田字型(圖2，14)或四面體型(圖2，15)。縱觀減數分裂全過程，未發現不育系與保持系間存在差異，不育系減數分裂無異常現象，同源染色體能正常聯會配對，并能正常分離，未發現染色體落后或小核的形成，細胞質也能正常分裂形成四分體，這表明不育系在小孢子發生期正常，可以形成正常的四分孢子。

2.2.2雄配子體的發育 隨著包裹四分體的胼胝質降解，四分孢子被釋放而分開形成單個游離的小孢子花粉，每個都是獨立完整的雄配子體。剛從四分體釋放出的初生小孢子體積小、細胞核大并位于中央，染色體仍清晰可數(圖3，1-A、B)。隨后小孢子迅速生長，體積增大，細胞外壁沉積孢粉質而增厚并具花紋及溝孑L，使染色體加深(圖3，1-C、D)。因此，正常發育小孢子單核初期后用品紅染色，外壁著色太深而看不到內核發育，采用洋紅染色或二者對染效果較好。單核期小孢子細胞核初期位于中央(圖3，2)，之后原生質液泡化，出現許多小液泡合并成1個大液泡，核被擠到一側(圖3，3)。單核經不均等有絲分裂形成二細胞小孢子(圖3，4)，生殖細胞又進行1次有絲分裂(圖3，5)，最終形成三細胞成熟花粉(圖3，6)。成熟期花粉中營養核功能減弱不易被染色，而2個精細胞清晰可見(圖3，7)。正常可育花粉粒圓形、飽滿且相互分散，充滿花藥囊并容易散出(圖3，8)。

不育系(4-05A)在四分孢子期時正常，4個小孢子能被釋放分開成為單核小孢子。但單核小孢子卻不能進一步發育成熟，觀察異常現象主要有：(1)小孢子多數僅在單核中期就停止發育(圖3，9-10)。胞質稀薄無液泡、細胞萎縮。有的小孢子能發育到單核靠邊期(圖3，11)，但未見有發育到二細胞期的；(2)小孢子體積小。細胞直徑從初生時10 um左右(圖3，9)，以后幾乎不再長大(圖3，11)，而正常發育的小孢子單核靠邊期時細胞直徑可達20-30um；(3)小孢子染色淺，用品紅染色也可透過外壁看到細胞核，而正常小孢子單核中期后外壁就很厚，證明不育系小孢子外壁生長受阻，僅少數小孢子可形成三裂萌發溝的外壁(圖3，11)；(4)小孢子在單核中期到靠邊期時就相互粘連(圖3，10)，即使通過用力敲片小孢子仍難散開，而正常情況下該時期小孢子極易從藥囊中擠出并游離散開；(5)成熟期花藥萎縮干癟不散粉，有的通過擠壓可看到粘在藥壁上的團狀物，是停滯發育后又嚴重粘連在一起的敗育花粉粒(圖3，12)，花粉中內容物已降解收縮而徹底敗育。

3 討論

3.1關于春蘿卜不育系4-05A的雄性不育類型

參照周長久等對蘿卜雄性不育性的劃分類型，本研究通過對春蘿卜不育系4-05A外部形態學觀察及小孢子敗育過程的細胞學研究將該不育材料歸為花粉敗育型，是最具有利用價值的類型。

3.2蘿卜減數分裂染色體行為的特殊現象

觀察春蘿卜小孢子母細胞減數分裂時發現，染色體從終變期開始到四分孢子已分開，很長一段時間都處于高度凝聚的超螺旋狀態，如果采用卡寶品紅染色，由于染色體著色反差大，核仁又不被染色，整個細胞核區經常可見染色體能被清晰計數。尤其是在終變期，小孢子母細胞發育整齊，染色體粗短且分散，幾乎能與中期I極面觀相媲美(圖3，6)，而且該時期明顯比其他科屬植物持續時間長易獲得。其他時期如后期I、末期I、中期Ⅱ、末期Ⅱ、四分孢子期及小孢子幼期都可進行染色體計數，甚至整個減數分裂期間的花藥藥壁細胞及絨氈層細胞染色體都表現出類似現象(圖2，16)。染色體這種持續非解旋現象可能與蘿卜等十字花科(Cruciferae)植物減數分裂過程屬胞質同時型有關，其他十字花科植物如大白菜也有類似情況，有待進一步研究探討。

3.3關于春蘿卜雄性不育系4-05A敗育時期探討

雄性不育花粉敗育時期和方式多樣，從小孢子造孢細胞到花粉成熟的各個發育時期都可發生，同一品系敗育特征既可出現在1個時期，也可出現在相鄰2個時期或多個時期。Laser在總結前人研究的基礎上，提出被子植物雄性不育系花粉敗育的形式和時期是多種多樣的，單子葉植物花粉敗育多數達到或接近雙核期，雙子葉植物花粉敗育則多在四分小孢子時期或小孢子早期發育階段。本研究結果表明，春蘿卜不育系4-05A在四分孢子期仍正常。敗育發生在小孢子早期發育階段的單核中期到靠邊期，單核小孢子出現異常，表現為停止生長，相互粘連。這一結果與董慶華等報道的蘿卜雄性不育系小孢子敗育其中的一種方式一花藥發育受阻于單核花粉期，以及粟翼玫等報道的秋冬蘿卜雄性不育系64A及其保持系64B花藥和小孢子的細胞學觀察結果相吻合：該結果與張麗等報道的蘿卜不育小孢子的敗育在造孢時期就已表現出來，以后在單核小孢子發育過程中繼續表現有所差異：也與梁小紅等對禾本科植物高粱不育系小孢子敗育的研究結果不同。

4 結論

(1)確認了春蘿卜雄性不育系4-05A具有雄性不育蘿卜花器特征，雄蕊花藥外形小、中空無花粉，雌蕊花柱較長。(2)觀察獲得春蘿卜雄性不育系4—05A及其相應的保持系4-05B小孢子發生及雄配子體發育的全過程，確定花粉敗育是4-05A雄性不育的根本原因，其不育類型屬于花粉敗育型。(3)不育系4-05A小孢子母細胞能正常進行減數分裂，形成單核花粉，減數分裂為同時型胞質分裂。(4)4—05A雄配子體進一步發育過程中，在單核中期到靠邊期的發育階段小孢子發生敗育，不能形成可育的成熟花粉粒，文中概括總結出5種敗育異常現象。