塞來昔布對大鼠蛛網膜下腔出血后遲發性腦血管痙攣的防治

[摘要] 目的 探討塞來昔布(Celecoxib)對遲發性腦血管痙攣的防治。方法 36只SD大鼠隨機分為對照組，蛛網膜下腔出血組，塞來昔布治療組，每組12只。應用枕大池二次注血法建立大鼠SAH模型，治療組第1次注血30min后給予塞來昔布灌胃，利用HE染色和透射電鏡分別觀察各組處理后第7天基底動脈形態學和超微結構改變。結果 (1)經塞來昔布治療后，治療組管徑顯著大于蛛網膜下腔出血組，管壁厚度顯著小于蛛網膜下腔出血組(P<0.05)，與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。(2)塞來昔布治療后痙攣血管的形態學和超微結構得到改善。結論 塞來昔布對蛛網膜下腔出血后遲發性腦血管痙攣有防治作用。

[關鍵詞] 蛛網膜下腔出血; 遲發性腦血管痙攣; 塞來昔布; 炎癥

[中圖分類號] R364.1+3;R743.35 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)05-27-03

An Experimental Study on Prevention of Cerebral Vasospasm with Celecoxib in A Rats of Delayed Subarachnoid Hemorrhage

GUANG Junrong TONG Haibo TANG Huoquan FAN Yimin LIU Yaoting HAO Jiehe

Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] ObjectiveTo investigate the effect of Celecoxib on cerebral vasospasm of subarachnoid hemorrhage. MethodsThirty six Sprague-Dawley rats are randomly separated into control group，subarachnoid hemorrhage group(SAH) and SAH+Celecoxib group.There were twelve animals in each group. SAH were developed with two times injections of 0.3mL arterial blood into cisterna magna，and 0.3mL saline was injectted in group NS by using same method. Rats in therapy group were lavaged with Celecoxib in thirty minutes after. blood injection first. We use the radial wall thickenss and cross-sectional lumen area after SAH seven days as parameters under light，transmission electron microscopy examination. Results(1)In the SAH+Celecoxib group ，the artery lumens dilated and the vessel wall thinned markedly than that of SAH group，but no significance compare with control group.(2)Celecoxib treatment reduced ultrastructural and morphometric vasospastic changes. ConclusionThe study results prove that Celecoxib can prevent the cerebral vasospasm in rats model of subarachnoid hemorrhage.

[Key words]Subarachnoid hemorrhage; Delayed cerebral vasospasm; Celecoxib; Inflammation

腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)是蛛網膜下腔出血(subarachnoid haemorrhage，SAH)患者致死和致殘的主要原因之一，發病率達45%，如何有效防治是當今神經外科研究的熱點。本實驗以大鼠SAH為模型，應用形態學、透射電鏡等方法探討塞來昔布對SAH后遲發性CVS的防治，為臨床應用塞來昔布治療遲發性CVS提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SD大鼠(山西醫科大學動物實驗中心提供)36只，體重250~300g，雌雄不拘。塞來昔布(Celecoxib，輝瑞公司生產)溶于純凈水中配成懸濁液備用。光學顯微鏡(Olympus，日本);Motic2000圖像分析系統;JEM-100CX透射電鏡。

1.2 模型制作

SAH:大鼠以10%水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉后，后頸部及左側股動脈區備皮;消毒后，大鼠仰臥位，暴露左側股動脈備用;然后改俯臥位，取枕外隆凸以下約2.0cm正中切口，暴露枕骨，環椎及環枕膜，用1mL注射器針頭刺破環枕膜并稍稍推進到達枕大池;有腦脊液流出后，用1mL注射器抽取股動脈血0.3mL，在2min之內注入枕大池;注血后俯臥位頭低約30°30'，以利血液沉積在腦底血管周圍，縫合頭皮及股部切口。48h后同法抽取右側股動脈血0.3mL注入枕大池，制成大鼠SAH動物模型。對照組:方法同上，兩次在枕大池注入溫生理鹽水0.3mL。

1.3 實驗分組

大鼠隨機分成對照組、SAH組、治療組各12只。藥物治療組:第1次注血后半小時給予塞來昔布懸濁液灌胃治療，按塞來昔布原藥8mg/100g給藥。隨后每天給藥1次，共7d。

1.4 標本制作

各組動物于模型制作后第7天用10%水合氯醛腹腔注射(0.3mL/100g)麻醉后，仰臥固定于手術臺上;自劍突下沿胸骨兩側旁開1.0cm向上剪開胸腔及心包，充分暴露心臟及主動脈，剪開左心室，將皮針插入主動脈約1cm，固定皮針并開始灌注，同時剪開右心室放血;灌注高度為120cm，快速灌注生理鹽水100mL，4%多聚甲醛緩沖液100mL(每組取8只);灌注完畢開顱取腦，分離腦干和基底動脈，取包含腦干的基底動脈上1/2段做標本，置于10%甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色。透射電鏡標本制作:其余動物用相同方法生理鹽水灌注后，采用戊二醛固定液100mL灌注固定后，迅速取基底動脈置于電鏡固定液中，采用電鏡標本制作法，清洗、脫水、浸透、包埋和修快后做超薄切片。

1.5 病理觀察

用顯微鏡計算機圖像分析系統，計算基底動脈管徑和基底動脈管壁厚度，測量血管壁厚度時測量血管四周四處壁厚值，然后取其均值。在透射電鏡下觀察內膜、內彈力膜、平滑肌及外膜的超微結構變化。

1.6 統計學處理

數據記錄用均數±標準差表示，采用SPSS11.5統計軟件進行統計分析，統計學方法采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，取P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基底動脈血管HE染色光鏡下觀察

對照組可見內皮結構完整，內彈力膜無卷曲，管腔較大。蛛網膜下腔出血組可見血管壁增厚，管腔狹窄;外膜增厚炎性細胞浸潤。治療組較蛛網膜下腔組相比管壁較薄，管腔較大，與對照組相比差別不大。

2.2 計算機圖像分析結果

各組基底動脈管徑，管壁厚度比較見表1，蛛網膜下腔組基底動脈管徑較對照組小，較治療組小(P<0.05);治療組與對照組比較無顯著差別(P>0.05)。蛛網膜下腔組基底動脈管壁較對照組、治療組厚(P<0.05);治療組與對照組比較，無明顯差異(P>0.05)。

2.3 透射電鏡下基底動脈超微結構變化

對照組基底動脈在透射電鏡下表現為正常超微結構特點，內皮細胞薄而規整，內有少量吞飲小泡、線粒體結構正常;內彈力膜及平滑肌無卷曲。蛛網膜下腔組表現為內皮細胞緊密連接消失，細胞扭曲、空泡形成，細胞質缺失，線粒體腫脹、嵴紊亂，空泡化，致密顆粒增多;內彈力膜變厚、皺褶;平滑肌變性壞死。治療組內膜、內彈力膜、平滑肌接近正常組織超微結構變化，僅有少量空泡形成。

3 討論

蛛網膜下腔岀血后的腦血管痙攣分為早期痙攣和遲發痙攣.后者在臨床上更常見，通常發生于SAH后3d，7~10d達高峰.然而，目前對遲發性腦血管痙攣的發生機制還不清楚，治療也未達到滿意的效果。近年來研究[1]表明，痙攣的血管壁明顯增厚并伴有炎癥細胞浸潤。認為SAH 引起的局部炎癥反應所致的結構性狹窄和內皮表面生化改變在遲發性腦血管痙攣中起重要作用。Osuka等[2]研究表明，COX-2在蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的急性和慢性階段表達上調。Fassbender等[3]研究表明，IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性介質在腦血管痙攣時表達上調且程度與血管痙攣時相相一致。環氧化酶COX是花生四烯酸轉化成前列腺素和血栓烷的限速酶，而前列腺素是重要的炎性介質。現己證明哺乳動物細胞中COX有兩種異構體，即環氧化酶-1(COX-1)和環氧化酶-2(COX-2)。COX-1存在于正常組織中，由它催化合成的PGE2和GPI2具有穩定細胞功能和保護細胞的作用，被稱為‘看家酶’。COX-2為誘導酶，在正常情況下細胞中極少，在機體受到損傷發生炎癥或組織生長狀態發生變化時，誘導激活COX-2，加劇炎癥反應[4]。

許多動物實驗證實，非甾體類抗炎藥可逆轉SAH后腦血管痙攣。Chyatte等[5]報道靜脈大劑量應用布洛芬可有效預防犬遲發性CVS，但會出現消化道岀血等副作用。Hakan等[6]用美洛昔康治療大鼠股動脈血管痙攣可明顯緩解血管痙攣并改善血管超微結構的炎性改變。非甾體抗炎藥(NSAIDs)發揮活性的主要機制是通過阻止COX途徑進而抑制PGs的合成達到抗炎作用，同時還可抑制白細胞內皮細胞黏附并降低細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)的表達[7]。塞來昔布是新一代非甾體抗炎藥，能選擇性地抑制COX-2，比對COX-1的抑制高375倍。可明顯減少傳統非甾體抗炎藥的副作用，為腦血管痙攣的治療提供了新的選擇。

本實驗應用枕大池二次注血法建立遲發性腦血管痙攣模型。夏建學等[8]研究報道該方法建立的遲發性腦血管痙攣模型穩定且與人類腦動脈瘤破裂后SAH腦血管痙攣時程相一致，且在第7天時痙攣達到高峰。本實驗治療組以塞來昔布灌胃作為給藥途徑，選取第一次注血后7d作為療效的觀察。實驗發現蛛網膜下腔組基底動脈管徑變小，管壁變厚，透射電鏡下可見血管內皮細胞緊密連接消失，內彈力膜皺褶，平滑肌細胞變性壞死，外膜炎性細胞浸潤，與Harrod[9]等報道基本相同。早期應用塞來昔布治療7d后，大鼠痙攣血管管壁厚度及管徑較SAH組明顯改善，超微結構與正常組比較相差不大。塞來昔布通過緩解蛛網膜下腔基底動脈的炎性反應，改善血管超微結構，減少血管功能的缺失，體現了塞來昔布對大鼠遲發性腦血管痙攣的治療作用。

研究結果表明，塞來昔布能預防遲發型腦血管痙攣的發生，為臨床應用塞來昔布治療腦血管痙攣提供實驗依據，同時也間接證實了炎性反應在遲發性腦血管痙攣中的作用，然而其防治作用是否具有量效關系仍值得進一步探索。

[參考文獻]

[1] Yamakawa K，Sasaki T，Tsubaki S，et al. Effect of high-dose methylprednisolone on vasospasm after subarachnoid hemorrhage[J]. Neurol Med Chir(Tokyo). 1991，31:24-31.

[2] Osuka K，Suzuki Y，Watanabe Y，et al. Inducible cyclooxygenase expression in canine basilar artery after experimental subarachnoid hemorrhage[J]. Stroke，1998，29:1219-1922.

[3] Fassbender K，Hodapp B，Rossol S，et al. Inflammatory cytokines in subarachnoid haemorrhage:association with abnormal blood flow velocities in basal cerebral arteries[J]. J Neurol Neurosurg Psychiatry，2001，70:534- 537.

[4] Reddy BS，Rao CV，Seibert K. Evaluation of cyclooxygenase-2 inhibitor for potential chemopreventive properties in colon carcinogenesis[J]. Cancer Res，1996，56(20):4566-4569.

[5] Chyatte D，Rusch N，Sundt TM. Prevention of chronic experimental cerebral vasospasm with ibuprofen and high-dose methylprednisolone[J]. J Ne- urosurg，1983，59:925-932.

[6] Hakan T，Berkman MZ，Ersoy T，et al. Anti-inflammatory effect of mel- oxicam on experimental vasospasm in the rat femoral artery[J]. J Clin Ne- urosci，2008，15:55-59.

[7] Diaz-Gonzalez F，Sanchez-Madrid F. Inhibition of leukocyte adhesion:an alternative mechanism of action for anti-inflammatory drugs[J]. Immunol Today，1998，19:169-172.

[8] 夏建學，審冰. 大鼠枕大池二次注血蛛網膜下腔出血延遲性腦血管痙攣模型的建立[J]. 寧夏醫學雜志，2006，28(6):410.

[9] Harrod CG，Bendok BR，Batjer HH. Prediction of cerebral vasospasm in patients presenting with aneurysmal subarachnoid hemorrhage:a review[J]. Neurosurgery，2005，56(4):633-654.

(收稿日期:2009-12-04)