離心分離法與貼壁分離法對培養骨髓間充質干細胞生物學特性影響

[摘要] 目的 探討分離高質量和高活性骨髓間充質干細胞的方法。方法 選取出生2月齡的健康兔，采用密度梯度離心分離法與貼壁分離法培養骨髓間充質干細胞，檢測培養骨髓間充質干細胞生物學特性。結果 貼壁分離法培養的原代骨髓間充質干細胞貼壁增殖快，細胞活性高，而密度梯度離心分離法培養的原代骨髓間充質干細胞貼壁增殖慢，細胞活性低，但這些差別在傳代后消失。離心分離法得到的細胞純度較貼壁分離法獲得的細胞純度高。結論 與離心分離法相比貼壁法獲得的原代骨髓間充質干細胞的細胞活性較高、貼壁增殖快，具有方法簡單的優點。

[關鍵詞] 骨髓; 間充質干細胞; 兔; 細胞培養

[中圖分類號] R329.2+8 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)05-29-03

Effects of Adherence and Density Gradient Centrifugation Methods on Biological Characteristlcs of Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells Cultured in Vitro

LI Ting1 SUN Jinhu1 ZHAO Liang2 LI Shuai1

1.College of Stomatology，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China;2.The people’s Hospital of Hechi City，Hechi 546300，China

[Abstract] ObjectiveTo study the effects of adherence and density gradient centrifugation(DGC) methods on biological characteristics of rabbit marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro. MethodsRabbits aged 2 months were used to isolate marrow mesenchymal stem cells(MSCs). MSCs with adherence and DGC methods were cultured，passaged，amplified and purified in vitro. The living characteristics and adhesive rate of the primary and generations were observed respectively. The growth curve was drawn. The cell cycles and cystoskeleton were tested to study the different MSCs separated methods on the proliferation and metabolism of MSCs. ResultsMSCs were intact and fibroblast cell-shaped. Adhering spindle-shaped cells with higher cytoactive were observed in the adherence and DGC separation groups. The MSCs of primary culture in the adherence group showed more rapid proliferation，earlier colony confluence and shorter time for passage compared with DGC separation group. ConclusionThe MSCs separated by adherence showed a rapid proliferation，earlier colony confluence and shorter time for the first passage.

[Key words]Marrow; Mesenchymal stem cells; Rabbit; Cell culture

骨髓基質中存在骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，其具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等多向分化潛能，是組織工程學技術的重要的種子細胞[1]。目前，國內外已分離培養出骨髓間充質干細胞(MSC)，但尚無統一的分離培養方案。雖然有多種MSCs的分離方法，但密度梯度離心法和貼壁分離法是目前骨髓間充質干細胞最常用的分離培養方法。本實驗應用密度梯度離心分離法與貼壁分離法對骨髓間充質干細胞進行分離培養，并比較分析這兩種分離法對MSC生物學特性的影響，為選擇對MSCs損傷小、易于貼壁生長和操作簡單的MSCs分離方法提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM/F-12培養基(Gibco，USA)，胰蛋白酶(Gibco，USA)，EDTA(sigma，USA)，胎牛血清(Gibco，USA)，其他均為國產分析純試劑。碘化丙啶、噻唑藍和二甲基亞砜均為SIGMA產品，Percoll為Pharmacia公司產品。實驗動物日本大耳白兔12只，體重2kg左右，雌雄隨機，動物飼養條件為25℃，濕度60%~ 70%。

1.2 方法

1.2.1 骨髓細胞的制備 用3%戊巴比妥鈉將兔全身麻醉，用脫毛劑脫去兔后下肢的毛發，用3%的碘酊和75%酒精徹底消毒兔后下肢后移入工作臺，鋪無菌巾，解剖出脛骨上、下端，用骨鉆分別在脛骨上端和下端打孔，暴露骨髓腔。用7號針頭刺入兩側骨端的骨孔內，用加有肝素的DMEM 培養基反復沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞懸浮液備用。

1.2.2 離心分離法制備MSCs 將骨髓細胞懸浮液貼壁加入到預置等體積1.077g/L的Percoll淋巴細胞分離液的離心管中，2000r/min離心20min。吸取中間乳白色的界面層，與5倍體積的生理鹽水混勻后1000r/min離心5min，除去殘留的Percoll成分。用磷酸鹽緩沖液洗滌1次，然后均采用F12-DMEM 培養液(含體積分數為0.1的進口胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素)重懸細胞，按1×105的密度接種于25mL培養瓶中，37℃、0.05%的CO2飽和濕度下培養，3d后首次更換培養液，棄去未貼壁細胞，此后2~3d換液1次。

1.2.3 貼壁分離法制備MSCs 將骨髓沖洗液放入平皿，再抽出平皿中液體對髓腔進行二、三次沖洗。用吸管反復吹打呈單細胞懸液，每個脛骨的骨髓單細胞懸液經接種入一個25mL培養瓶中，于37℃ 、體積分數為0.05的CO2孵箱飽和濕度培養，5d后首次更換培養液，棄去未貼壁細胞，此后每三四天換液1次。

1.3 細胞計數、細胞形態學觀察

在倒置顯微鏡下，每天觀察貼壁分離培養、密度梯度離心培養條件下的原代及傳代細胞的生長情況和活體形態特征。MSCs活力測定取1～3代傳代細胞，制成單細胞懸液，以0.4% 臺盼藍作為染色劑，用細胞計數板計數活細胞和死細胞，共3次，取3次平均值，計算細胞活力:活細胞率(%)=活細胞數/(總細胞數-著色細胞數)×100。骨髓間充質干細胞按2×104/孔接種于24孔培養板中。分別于接種后第2，3，4，5，6，7天收集4個復孔細胞(注:原代培養細胞于接種后4d換液時開始，即4，5，6，7，8，9， 10，11，12，13，14，15，16)，用酚酞藍拒染法計數活細胞。根據計數結果繪制生長曲線。取MSCs按2×104個細胞/孔接種于24孔培養板內，從接種后第2天起，每日隨機收集4個復孔細胞用計數，取均數描記生長曲線。

1.4 MSCs傳代培養

原代細胞長滿單層后，即可進行傳代，首先棄去培養液，用CMF-PBS液洗細胞兩次后，加入消化液(0.25%胰蛋白酶+0.01% EDTA)約1mL，消化約5min，倒置顯微鏡下證實細胞已完全分離(此時鏡下可見細胞呈圓球形)，加入4mL含血清培養基，反復輕輕吹打成單細胞懸液，離心并用無血清培養基洗滌1次后重新加入含血清培養基計數，按所需密度傳代培養或冷藏。

1.5 MSCs細胞的HE、Gimas染色及細胞骨架制備

Gimas及HE染色采用文獻報道方法，細胞骨架制備按參考文獻[2]方法。

1.6 MSCs流式細胞儀觀察制樣

按文獻[2]的方法制備觀察樣本，用流式細胞光度計(FCM)檢測，采用激發波長為488nm的氬離子激光，DNA被PI著色成紅色熒光，蛋白質被FITC著色成綠色熒光，打印出各組細胞周期所占百分比，計算增殖指數(proliferation index，PIX)衡量細胞的增殖活性，PIX=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%。兩組檢測數據用均數±標準差(χ±s)表示，各項指標差異顯著性用t 檢驗。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察

2.1.1 密度梯度離心法 細胞培養24h后，均可見大圓形細胞與少量小圓形細胞懸浮于培養液中，4d首次換液后可見少量細胞呈短梭形、多角形細胞及三角形，培養到12~14d細胞增殖鋪滿至80%左右，15~16d細胞增殖逐漸匯合成單層細胞。傳代后至第3代時細胞形態較均勻，呈長梭形集落狀分布。

2.1.2 貼壁分離法 細胞培養24h后，均可見數目較多的小圓形細胞、血細胞懸浮于培養液中。4d時首次換液后可見到梭形、多角形細胞及三角形的貼壁細胞;第7~ 8天可見這些細胞呈集落樣分布;至第10~12天細胞增殖鋪滿至80%左右，14~15d時增殖逐漸匯合成單層細胞。Gimas 染色可見細胞核為紫紅色，圓形或橢圓形，鏡下可見分裂相細胞，兩種分離方法未見不同。(圖1)

2.2 細胞活性檢測

密度梯度離心法:活細胞率為96.2%，貼壁分離法:活細胞率為98.7%，組間比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.3 細胞生長曲線

見圖4，應用密度梯度離心法與貼壁分離法第1代細胞生長曲線測定結果是密度梯度離心法的MSCs生長期比貼壁分離法MSCs的生長曲線延遲1~2d。第2、3代細胞生長曲線測定結果，細胞生長曲線基本相似，在培養1d時，細胞量稍有減少;第2天開始至第6天，細胞呈指數生長，細胞數迅速增長，7d進入平臺期，此后細胞數目無顯著改變，細胞增殖減慢(圖2)。

2.4 培養MSCs細胞骨架觀察

鏡下可見細胞骨架主要結構形式為環形排列，貫以輻射狀微管組成圓形蜘蛛網形，細胞間有角形的突起。隨著細胞傳代次數的增大，細胞骨架逐漸過渡到以梭形細胞骨架為主要形式(圖3)。

2.5 培養MSCs的細胞周期

第3代MSCs培養72h后，經PI和FITC雙染在流式細胞儀下觀察分析可見細胞增殖活躍，細胞蛋白質含量較豐富。貼壁法MSC:G1期細胞為67.5%，G2期細胞為28.9%，S期細胞為3.6%，細胞增殖指數為(PIX)32.5%，離心法MSC:G1期細胞為68.2%，G2期細胞為28.1%，S期細胞為3.7%，細胞增殖指數為(PIX)31.8%，經統計學分析貼壁法和離心法MSC的PIX差別無意義(表1)。

3 討論

骨髓間充質干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是具有不斷增殖和自我更新能力的成體干細胞之一，在適當的條件下，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞[3-7]。獲得大量高純度的MSCs是將MSCs用于研究或臨床治療的基礎，目前用于分離MSCs的方法主要有貼壁分離法、密度梯度離心法、流式細胞儀分離法和免疫磁珠分離法。其中后兩者由于所需儀器昂貴、對MSCs損傷較大加之骨髓間充質干細胞尚未發現其特有的表面標志，故較少應用[3]。目前常用方法仍為貼壁法和密度梯度離心法。

本實驗采用貼壁法分離培養小鼠骨髓間充質干細胞，隨著細胞傳代，去除其它可貼壁的雜質細胞，傳過三代后細胞形態趨向一致，獲得較為純化的梭形成纖維樣細胞(MSCs)。應用密度梯度離心法在原代培養獲得的細胞，仍需用貼壁法進一步純化，并且其操作步驟復雜，離心過程中不可避免地造成細胞損失或損傷，同時發現其原代培養時細胞的活性和生長曲線都遲于貼壁法分離的MSCs，而且MSCs貼壁所需的時間較貼壁分離法長，這可能與離心過程中丟失了骨髓微環境中對骨髓間充質干細胞生長有利的細胞因子和促貼附物質有關。原代培養中可見離心法的MSCs純度較貼壁法的MSCs大，但隨著細胞的傳代，兩者之間的差別逐漸消失。本實驗發現應用離心分離法與貼壁分離法經過傳代都可獲得活性好、形態均一的骨髓間充質干細胞，但在實驗過程中要避免軟組織的細胞污染沖洗出的骨髓細胞，對所用試劑盡量做到現用現配。同時應用離心分離法時應注意時間不能過長，離心力不能過大，盡量減少細胞的損傷。本研究揭示雖然密度梯度離心法理論上可在原代獲得較純化的細胞，但仍需用貼壁法進一步純化，而且容易發生細胞污染和損傷等，因此其并不具有明顯優勢，相反貼壁分離法具有方法簡單、細胞損傷小等優點。

總之，本實驗應用的兩種方法均可獲得可靠的MSCs。對原代培養的MSCs，貼壁分離法具有對MSCs損傷小、易于貼壁生長和操作簡單等優點，但其MSCs純度較離心分離法稍低。經過多次傳代后采用兩種方法所獲得的MSCs的生物學特性已無區別，均可獲得具有良好的活性的MSCs。

[參考文獻]

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(收稿日期:2009-09-26)