靶向OPN的miRNA對人肺腺癌細胞株A549順鉑敏感性的影響*

[摘要] 目的 通過miRNA介導RNAi沉默OPN表達探討其對人肺腺癌細胞株A549順鉑(DDP)敏感性的影響。方法 利用體外構建的靶向OPN的miRNA表達質粒瞬時轉染A549，酶聯免疫吸咐法(ELISA)檢測轉染后48h細胞OPN蛋白表達;轉染后24、48、72、96h，四甲基偶氮唑藍(MTT)法分別檢測轉染細胞和轉染聯合5μg/mL順鉑作用后細胞的增殖;于轉染后24h聯合不同濃度的順鉑作用48h，MTT法檢測細胞增殖抑制率。結果 (1)轉染后48h，OPN蛋白表達水平下調了47.34%(P<0.01)。(2)轉染后24h細胞增殖開始受抑制(P<0.05)，48、72、96h細胞增殖被明顯抑制，細胞增殖活性差異均有統計學意義(P<0.01)。(3)轉染聯合順鉑作用24 h細胞增殖開始受抑(P<0.05)，48、72、96h細胞增殖明顯受抑，細胞增殖活性轉染組與未轉染組及非特異性轉染組差異均有統計學意義(P<0.01)。轉染后24h聯合不同濃度的順鉑作用48h，當順鉑濃度為2.5、5、10、20μg/mL時，細胞增殖被明顯抑制，細胞增殖抑制率差異均有統計學意義(P<0.01)。結論 靶向OPN的miRNA抑制人肺腺癌細胞A549增殖，增強細胞對DDP的敏感性。

[關鍵詞] 肺腺癌; OPN; miRNA; 順鉑

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)05-04-04

Effects of miRNA Specific for OPN on Cisplatin Sensitivity of Lung Adenocarcinoma Cell Line

TANG Rong1 JIE Kemin2 YU Xiaochun3 ZHU Weifeng2 YU Lehan2 ZHU Bailu1

1.Medical Department，Graduate School of Nanchang Universty，Nanchang 330006，China;2.Department ofBiochemistry and Molecular Biology，Medical College of Nanchang University，Nanchang 330006，China;3.Institute of Acupuncture and Moxibustion，China Academy of Traditional Chinese Medicine Sciences，Beijing 100700，China

[Abstract]Objective To explore the drug sensitivity of lung adenocarcinoma cell line A549 to cisplatin(DDP) by miRNA specific for OPN gene. MethodsMicroRNA targeting OPN gene was transfected transiently to A549 cells by the expression plasmids which were constructed in vitro. The level of OPN protein in the A549 cells at 48 h after transfection was measured with ELISA. The cells incubated and non-incubated with 5μg/mL DDP were detected by MTT at 24，48，72 and 96 h after transfection. And the cells were cultured at different concentrations of cisplatin(DDP) for 48h，the growth inhibition rate was evaluated by MTT. Results(1)The OPN protein level was decreased by 47.34% at 48 h after transfection(P<0.01). (2)The cell proliferation started to be inhibited at 24 h after transfection(P<0.05)，and was significantly inhibited at 48，72 and 96 h after transfection，with a significant difference(P<0.01). (3)After the treatment with 5μg/mL DDP，the cell proliferation started to be inhibited at 24h after transfection(P<0.05)，and was significantly inhibited at 48，72 and 96h after transfection，with a significant difference in the cell proliferation activity between the transfection group and non-transfection group or non-specific transfection group(P<0.01). At 2.5，5，10 and 20μg/mL DDP，the cell proliferation was significantly inhibited，with a significant difference in the cell proliferation inhibition rate(P<0.01). ConclusionMicroRNA targeting OPN gene can effectively inhibite the cell proliferation of lung adenocarcinoma cell line and enhances the cell chemosensitization to DDP.

[Key words]Lung adenocarcinoma; OPN; miRNA; Cisplatin

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，我國肺癌的發病率和死亡率呈逐年上升趨勢且發病年齡日趨年輕化[1]。骨橋蛋白(OPN)與腫瘤的生長轉移及血管發生密切相關[2]，作為腫瘤標志物和基因治療的靶點日益受到關注。RNA干擾(RNAi)廣泛用于抑制基因表達和研究基因功能，它由microRNA(miRNA)和小分子干擾RNA(siRNA)兩種小RNA分子介導。本實驗研究miRNA介導的RNAi特異沉默OPN表達對A549細胞DDP敏感性的影響，為肺癌的化療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

A549細胞株由本實驗室保存，DMEM培養基購自Gibco公司，胎牛血清為杭州四季青公司產品。重組質粒PcDNA6.2-GW/ EmGFP-miR-OPN/Negative、脂質體lipofectamine 2000購自Invitrogen公司;質粒小提試劑盒購自Promega公司;大腸桿菌菌株One Shot TOP10購自北京全氏金公司;細胞蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天公司。人OPN ELISA試劑盒購自武漢博士德生物科技公司。大觀霉素(spectinomycin)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)為Sigma公司產品。順鉑購自山東羅欣藥業公司。

1.2 方法

1.2.1 miRNA重組質粒的擴增與純化 -80℃冰箱取出100μL TOP10冰上融化后每100μL加入特異性干擾質粒(miRNA-OPN)和陰性對照質粒(miRNA-negative control)各2μg混勻，冰浴30min。42℃水浴90s，冰上放置1min后加入37℃溫育的LB培養基100μL，37℃ 200rpm/min水平振搖1h。各取100μL轉化菌涂布于LB/spectinomycin(50μg/mL)固體瓊脂平板上，37℃恒溫過夜，單個菌落為轉化菌落。用滅菌的10μLTip頭各挑取3個單克隆菌落接種到LB/ spectinomycin液體培養基中，37℃搖菌過夜，設置不加轉化菌的陰性對照。次日收集細菌，按說明書快速提取小量質粒DNA，紫外分光光度計測定質粒濃度和260/280吸光度比值。

1.2.2 肺腺癌細胞株A549細胞培養與轉染 對數生長期A549細胞按5×105/孔移至六孔板，細胞80%融合時進行轉染。實驗分為未轉染組、轉染組和陰性對照組。未轉染組不轉染miRNA，轉染組轉染miRNA-OPN，陰性對照組轉染miRNA-negative control，每組三個復孔。按照Lipofectamine 2000說明書操作，4h后更換完全培養基繼續培養。

1.2.3 ELISA法檢測OPN的表達 細胞轉染后48h收集細胞加250μL蛋白裂解液于4℃，30min裂解細胞。BCA法總蛋白定量。取裂解上清液按OPN說明書操作，酶標分析儀測定450nm吸光度(A)值。CurveExpert1.3軟件繪制標準曲線，并計算樣品中OPN含量。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖活性及細胞增殖抑制率 A549細胞在6孔板中轉染miRNA后24h接種96孔板，細胞密度為(3×103)個/孔，每組細胞設6個復孔。培養24h后更換終濃度為5μg/mL DDP的DMEM培養液，分別在24、48、72、96h加入5 mg/mLMTT溶液20μL，繼續培養4h后離心棄上清加入150 μL DMSO震蕩10min，酶標分析儀測定490nm吸光度(A)值，作細胞增殖曲線。細胞增殖抑制率(inhibition rate，IR)的檢測為轉染后24h加入不同濃度的順鉑(0、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL)繼續作用48h后測定吸光度(A)值，測定方法同上。設未轉染的細胞作為對照，重復實驗3次取平均值。IR的計算方法是(1-A試驗組/ A對照組)×100%，計算細胞對順鉑的半數抑制濃度(IC50)。

1.3 統計學處理

統計學處理采用統計學軟件 SPSS 13.0 分析，實驗數據以χ±s表示，多組間參數采用單因素方差分析，多組間參數兩兩比較采用q檢驗，不同時點的計量資料處理應采用重復資料的方差分析。

2 結果

2.1 miRNA轉染后OPN蛋白抑制

ELISA結果表明miRNA-OPN能有效沉默OPN蛋白表達。轉染后48h轉染組，未轉染組和陰性對照組細胞蛋白水平分別413.47、785.20、759.93pg/mL。轉染組降為未轉染組的52.66%(F=274.88，P<0.01)，而陰性對照組為96.78%，與未轉染組差異無顯著性，見圖1。

2.2 miRNA轉染后細胞的增殖情況

分別在轉染后24、48、72、96h加入MTT溶液測定A值。轉染組，未轉染組和陰性對照組在24h分別為1.08±0.07，1.23±0.09，1.21±0.09;48h為1.36±0.11，1.84±0.16，1.81±0.16;72h為1.54±0.13，2.20±0.19，2.17±0.16;96h為1.71±0.14，2.39±0.21，2.42±0.22。轉染組A549生長速度明顯減慢(圖2)，各組細胞A值比較差異均有顯著性(方差分析，24h F=4.84，P<0.05， 48~96h F值分別為:26.70，31.62，22.85，P<0.01)，其中轉染組與未轉組和陰性對照組相比有顯著性差異(q檢驗，24h P<0.05， 48~96h P<0.01)，表明靶向沉默OPN基因表達后，細胞的增殖能力明顯下降。

2.3 miRNA聯合順鉑作用后細胞的增殖抑制情況

轉染后24h加入DDP(5μg/mL)繼續作用48h，分別在24、48、72、96h加入MTT測定A值。在DDP的作用下，轉染組，未轉染組和陰性對照組在24h分別為1.03±0.07，1.21±0.10，1.19±0.10;48h為0.41±0.03，0.68±0.05，0.65±0.04，72h為0.29±0.01， 0.49±0.02，0.47±0.03，96h為0.18±0.01，0.33±0.02，0.32±0.02。轉染組生長受抑更為明顯(圖3)，各組細胞A值比較差異有顯著性(方差分析，24h F=6.19，P<0.05，48~96h F值分別為:67.53， 83.69，129.74，P<0.01)，其中轉染組與未轉染組和陰性對照組相比有顯著性差異(q檢驗，24h P<0.05，48~96h P<0.01)。在轉染24 h后加入不同濃度的順鉑(1.25、2.5、5、10、20μg/mL)繼續作用48h，MTT法檢測轉染組與未轉染組和陰性對照組IR分別為(26.58±0.04)%、(20.00±0.04)%、(22.66±0.05)%;(60.87±0.07)%、(41.30±0.05)%、(44.57±0.06)%;(77.72±0.06)%、(63.04±0.06)%、(64.67±0.07)%;(85.87±0.08)%、(73.91±0.07)%、(73.37±0.07)%;(92.93±0.06)%、(82.60±0.06)%、(81.52±0.05)%。與未轉染組和陰性對照組比較，順鉑濃度為1.25μg/mL時，差異無統計學意義(F=2.69，P>0.05);順鉑濃度分別為2.5、5、10、20 μg/mL時，轉染聯合順鉑作用組細胞增殖被明顯抑制，差異均有統計學意義(F值分別為:31.22，67.53， 93.78，121.48，P<0.01)。見圖4。順鉑的IC50由3.20μg/mL下降為2.05μg/mL。

3 討論

OPN是首先在骨基質中發現的一種磷酸化糖蛋白，它在組織和細胞中廣泛表達。早期它被稱為骨基質蛋白，T淋巴細胞活化蛋白(Eta-1)和細胞轉化相關蛋白。人OPN 基因由位于4號染色體上的單拷貝基因編碼，包含314個氨基酸殘基，其分子量介于41~75 KD，這種分子量的差異主要是由轉錄后修飾的不同引起。OPN分子富含天冬氨酸和絲氨酸殘基，不同種屬動物都具有特異性保守序列，包括7～10個連續的Asp序列，信號肽序列，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg–Gly-Asp，RGD)序列，酪氨酸激酶磷酸化識別序列。通過這些基序，OPN與不同受體分子相互作用，介導多樣的生物學功能[3]如骨的礦化、吸收和形成，細胞黏附、趨化和遷移，信號轉導，免疫調節，血管發生和抑制細胞凋亡等。OPN在多種正常組織和細胞中不表達或低表達。許多類型的腫瘤如:乳腺癌、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、卵巢癌和黑色素瘤OPN表達都升高，且與腫瘤的進展和轉移相關。此外，OPN在一些轉移癌病人的全血和血漿中也有高表達[4]。Hu[5]等對479例非小細胞肺癌組織的研究表明，腫瘤組織OPN陽性表達率明顯升高，且與腫瘤的大小、分期和轉移相關。此外，病人血漿OPN水平明顯高于健康人和肺部良性病變病人，各期肺癌病人有顯著性差異。Boldrini[6]等研究表明，OPN的表達是Ⅰ期非小細胞肺癌病人惡性進展的重要指標，與病人的生存率緊密相關。與OPN生物功能密切相關的基序[7]主要有二個與整合素，三個與CD44結合的位點和一個凝血酶裂解位點。通過αvβ3整合素、FAK、PI3K、Akt、ERK和NF-κB信號通路的調節，利用不同濃度的整合素和OPN處理A549細胞后，細胞的遷移能力顯著提高[8]。除此以外，OPN還含有糖基化位點、鈣離子，肝素結合位點，基質金屬蛋白酶酶切位點，經剪切后一些隱含于蛋白氨基酸鏈內部的受體結合部位被暴露出來，從而介導與多種受體的結合。有研究表明MMP-9與原發性肺癌及肺轉移密切相關[9]。

RNAi廣泛用于抑制基因表達和研究基因功能。它是指細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA(dsRNA)時，mRNA發生降解而導致基因表達沉默。這種現象發生在轉錄后水平，又稱為轉錄后基因沉默(PTGS)。RNAi可由miRNA和siRNA兩種形式的小RNA介導。siRNA在腫瘤基因治療方面取得了重大進展。研究表明靶向OPN的siRNA能有效沉默基因表達，使細胞生長速度減慢，侵襲和轉移能力減弱，并抑制裸鼠體內腫瘤生長[10-14]。最近越來越多的研究人員通過模擬體內天然miRNA的成熟過程，利用帶有polⅡ啟動子的表達載體表達具有miRNA前體結構的shRNA來進行RNAi的研究，且具有更強的RNA干擾效應[15]。由慢病毒介導的miRNA干擾抑制肝癌細胞OPN蛋白表達從而使細胞生長速度明顯減慢，細胞侵襲能力減弱[16]。本研究使用的干擾質粒由 Invitrogen公司構建，可在動物細胞內表達靶向調控OPN基因的miRNA。該質粒以鼠miR-154序列為骨架，且帶有巨細胞病毒啟動子，并優化莖環結構確保目的基因的高效敲除率。該質粒帶有加強型綠色熒光蛋白(EmGFP)基因，可很方便地示蹤miRNA的表達情況，并提供了EmGFP表達與miRNA基因敲除效率的強對比。本實驗結果顯示轉染48h后，OPN蛋白水平下降了47.34 %。在轉染48、72、96h后，轉染組細胞生長曲線明顯下移，細胞生長速度減慢。說明抑制OPN表達后，A549細胞的惡性增殖得到一定控制，為肺癌的基因治療提供實驗基礎。

DDP是肺癌臨床治療的首選藥物。它是細胞周期非特異性藥物，可以和細胞內堿基結合，造成DNA結構和功能損傷，促進細胞凋亡。本研究結果顯示，轉染聯合順鉑作用后細胞生長受抑制，與單純DDP作用的細胞組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。當順鉑濃度分別為2.5、5、10、20 μg/mL時，轉染聯合順鉑作用后A549細胞的增殖被明顯抑制，IR分別為(60.87±0.07)%、(77.72±0.06)%、(85.87±0.08)%和(92.39±0.06)%，差異均有統計學意義(P<0.01)。順鉑的IC50由3.20μg/mL下降為2.05μg/mL。有研究表明特異性沉默表皮生長因子受體(EGFR)基因表達能增強A549對DDP治療的敏感性[18]。Xie[19]等人應用高效液相色譜(HPLC)分析由慢病毒介導的靶向ATP結合盒亞家族ABCC2基因表達下調后，細胞內DDP濃度增加了2~3倍，細胞對DDP的敏感性增強[19]。這些實驗結果都表明一些基因的表達與順鉑耐藥緊密相關，其機制還不十分清楚，其可能的解釋包括細胞對DDP解毒增強，細胞內藥物濃度的改變，DNA修復能力的增強以及抑制細胞凋亡等[17]。DDP的應用有劑量限制性，最重要的是它的神經毒性導致的周圍神經病變、耳鳴、聽力喪失及耐藥性的產生。此實驗的結果表明，有效沉默OPN表達能增強A549細胞對DDP的敏感性，從而降低DDP的毒副作用和耐藥性的產生，改善病人預后，為肺腺癌治療提供實驗依據，但其臨床應用仍是一個需要解決的問題。

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(收稿日期:2009-11-24)