人bFGF重組慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs的實驗研究

[摘要] 目的 探討攜帶人bFGF和GFP基因慢病毒(lenti-bFGF-GFP)轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)及不同MOI(multiplicity of infection)的轉(zhuǎn)染效率。方法 實驗組:帶有bFGF和GFP基因慢病毒感染的BMSCs(bFGF -GFP-BMSCs)。空載體組:帶GFP基因慢病毒感染的BMSCs(GFP-BMSCs)。空白組:未經(jīng)感染的BMSCs;ELISA、RT-PCR檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)72h后bFGF的表達(dá)。MOI分別為10、30、50轉(zhuǎn)染BMSCs的轉(zhuǎn)染率。結(jié)果 bFGF -GFP-BMSCs組表達(dá)bFGF蛋白量經(jīng)ELISA、RT-PCR檢測均明顯高于GFP-BMSCs組和BMSCs組。MOI為10、30、50、的轉(zhuǎn)染效率分別為36.6%、84.2%、98.5%。結(jié)論 帶有bFGF和GFP基因慢病毒成功轉(zhuǎn)染骨髓間質(zhì)干細(xì)胞并表達(dá)，為bFGF基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷奠定了基礎(chǔ)。MOI為50時，BMSCs的轉(zhuǎn)染率超過85.0%。

[關(guān)鍵詞] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;慢病毒;堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF);綠色熒光蛋白(GFP);基因轉(zhuǎn)染

[中圖分類號] R318.5[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)06-13-04

Experimental Study on bFGF Gene Lentiviral Vector Transfecting BMSCs

WANG XinwuLIU Wenge

Department of Orthopedics，Xiehe Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350001，China

[Abstract] Objective To explore the ways of bFGF and green fluorescent protein(GFP) gene highly transfected to MSCs by lenti-bFGF -GFP and the efficiency of different MOI(multiplicity of infection)transfected to MSCs. Methods MSCs was subject to different treatments with three groups，that was bFGF-GFP-BMSCs group， GFP-BMSCs group and BMSCs group. 72 hours after culture of MSCs，ELISA and RT-PCR was adopted to quantify the amount of protein and mRNA of bFGF in the different groups. The transfection of different MOI(10，30，50) was transfected into BMSC. Results Both ELISA and RT-PCR experiments discovered this:72 hours after transfection，the amount of bFGF protein of bFGF-GFP-BMSCs group was much higher than these of the GFP-BMSCs group and BMSCs group. When the MOI equal to 10，30，50，the efficiency of lentivirus transfected into MSCs was 36.6%，84.2%，98.5%. Conclusion Lentivirus mediated by bFGF gene and GFP gene can infect MSCs successfully and which can express and secret bFGF protein after transfection. MSCs infected by lentivirus which was mediated by bFGF gene and GFP gene is an efficient way for gene therapy of spinal cord injury(SCI). When MOI equal to 50，the efficiency exceeded 85.0%.

[Key words] Mesenchymal stern cells;Lentivirus;Basic fibroblast growth factor(bFGF);Green fluorescent protein(GFP);Gene transfection

脊髓損傷后損傷節(jié)段出現(xiàn)軸突的斷裂和髓鞘的崩解，伴隨著出現(xiàn)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的壞死與凋亡，局部形成空洞和瘢痕組織，正常的神經(jīng)傳導(dǎo)通路被破壞，干細(xì)胞移植以及神經(jīng)組織工程被認(rèn)為是最有希望治療脊髓損傷的途徑之一[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells BMSCs)是干細(xì)胞移植進(jìn)行基因治療的理想種子細(xì)胞，它不僅可以攜帶目的基因，而且還可以發(fā)揮細(xì)胞替代和細(xì)胞本身的特殊作用[2]。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF 或FGF-2)是成纖維細(xì)胞生長因子家族的基本成員，在多種細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等)的增殖、遷移、分化和生存中起到重要的支持作用[3]。人bFGF有5個亞型，分別為18、22、22.5、24和34KD，其中18KD為基本亞型，其通過旁分泌和自分泌途徑來促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移[4]。目前國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于將bFGF構(gòu)建在慢病毒載體上，并將其轉(zhuǎn)染MSCs的研究，因此我們擬將帶有18KDbFGF基因和報道基因GFP的慢病毒(1entiviral vectors)載體轉(zhuǎn)染BMSCs，為進(jìn)一步研究bFGF基因轉(zhuǎn)移對脊髓損傷研究提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要材料和試劑

①儀器與試劑:低糖型DMEM培養(yǎng)基(DMEM-LG)、胎牛血清、胰酶購自Gibco公司，小鼠抗大鼠CD44PE、CD106PE、CD45PE、CD11bPE購自美國sigma公司，小鼠抗大鼠CD34FITC、CD90FITC購自ABD公司，RT-PCR試劑盒購自Fermentas，TRIZOL購自invitrogen，DNAMarker(Bioer)，倒置顯微鏡(Olympus，日本)，紫外分光光度儀(美國vltrospec 3100 pro)，PCR擴增儀(美國Axygen)，凝膠圖像分析系統(tǒng)gene genius(美國 syngene)。②實驗動物:清潔級120g SD大鼠，雌雄不限，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。③病毒株:攜帶人bFGF和GFP基因的慢病毒載體(lenti-bFGF-GFP)、攜帶GFP基因的慢病毒載體(lenti-GFP)購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)及流式細(xì)胞儀表型的鑒定 采用全骨髓法。取體重為80～120gSD大鼠(雌雄不限)，腹腔注射水合氯醛(0.3mL/100g)，浸泡于75%乙醇中10min，無菌條件取雙側(cè)股骨、脛骨，剪斷兩端，用注射器吸取適量DMEM液沖洗股骨、脛骨骨髓腔，將團(tuán)塊細(xì)胞吹勻制成細(xì)胞懸液，接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)。3d換液以去除未貼壁的造血干細(xì)胞，此后每3～4 天換液1次，待貼壁的成纖維樣細(xì)胞達(dá)到80%融合時，用0.25%胰蛋白酶2～3min，按1∶2～3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并記做第1代，標(biāo)記為P1，依此類推。經(jīng)2～3次傳代即可獲得形態(tài)均一的MSCs。取第3代已達(dá)融合的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化制備成單細(xì)胞懸液，離心后以100μL流式buffer重懸，每個檢測管中加入重懸細(xì)胞3×105個，取7管分別加入含CD44PE、CD106PE、CD45PE、CD11bPE、CD34FITC、CD90FITC 單克隆抗體，剩余1管不加任何抗體，作空白對照;避光室溫孵育30min，1000r/min離心5min，棄上清，以洗脫未結(jié)合上的流式抗體洗滌，加入300μL buffer，混勻送流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.2慢病毒感染BMSCs取處于對數(shù)生長期的MSCs進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為5×104。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)待細(xì)胞融合度達(dá)到約30%。根據(jù)細(xì)胞MOI分別為10，30，50加入5×105，1.5×106，2.5×106量的攜帶人bFGF和GFP基因的慢病毒(lenti- bFGF-GFP)，polybrene至終濃度為5μg/mL 感染MSCs，72h后觀察慢病毒上報告基因GFP 的表達(dá)情況。于熒光顯微鏡下觀察和拍照，隨機選取5個高倍鏡視野，拍完熒光照片后，在同一視野下拍白光的細(xì)胞照片。并根據(jù)轉(zhuǎn)染效率公式:綠色熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，計算相應(yīng)MOI值轉(zhuǎn)染MSCs的效率。

1.2.3ELISA檢測轉(zhuǎn)染后MSCs中bFGF蛋白的表達(dá)分別收集經(jīng)lenti-bFGF-GFP、lenti -GFP轉(zhuǎn)染BMSCs72h后的培養(yǎng)液上清和未經(jīng)轉(zhuǎn)染的BMSCs72h后的培養(yǎng)液上清，各取6份培養(yǎng)液上清加到用抗人bFGF單抗包被96孔板中，參照bFGF ELISA定量試劑盒(上海博光科技有限公司)說明進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定，經(jīng)加樣、洗滌、加生物素標(biāo)記的抗-IgG抗體、加鏈霉親和素-HRP并終止、測定。計算:標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即可得到培養(yǎng)液中bFGF的濃度。

1.2.4RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后MSCs中bFGF基因的表達(dá)取MOI為50，MSCs分別轉(zhuǎn)染lenti-bFGF-GFP和lenti-GFP及未轉(zhuǎn)染的MSCs培養(yǎng)后72h，棄上清液，用PBS洗滌2遍后，按Trizol一步法提取總RNA并行RNT光譜分析及定量，每管抽提的細(xì)胞RNA樣本取1μL用1‰DEPC水稀釋100倍，在紫外分光光度計上測定OD260/OD280的值及RNA的濃度。按RT-PCR試劑盒的說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)總體積30μL，反應(yīng)條件為95℃ 5min;94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30個循環(huán)后，于72℃延伸10min。引物的序列如下:擴增bFGF基因的上游引物為5’AGAGCGACCCTCACATCAAG 3’，下游引物為5’ACTGCCCAGTTCGTTTCAGT3’，擴增產(chǎn)物為234bp。擴增內(nèi)參照β-actin 基因的上游引物為5’TGTTGTCCCT GTATGCCTCTG3’，下游引物為5’ACCGCTCATTGCCGATAGT G3’擴增產(chǎn)物為348bp。反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定檢測PCR產(chǎn)物，并用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞培養(yǎng)相態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

全骨髓培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)BMSCs，倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代細(xì)胞剛接種時呈圓形，多數(shù)懸浮于培養(yǎng)液中，可見MSCs顯圓形分布，折光性好，胞體透亮，與周圍的血系細(xì)胞相互混雜，3d后大部分細(xì)胞都貼壁，呈梭形的成纖維細(xì)胞樣或多角形改變，核較大，位于細(xì)胞中央或邊緣。仍有大量懸浮混雜細(xì)胞。6d細(xì)胞呈現(xiàn)克隆樣生長的集落，集落細(xì)胞增殖迅速，細(xì)胞形態(tài)基本為紡錘形的成纖維細(xì)胞樣，部分呈寬大扁平的多邊形，懸浮混雜細(xì)胞明顯減少。約10～12d時融合成單層，一般能夠達(dá)到80%～90%，梭型細(xì)胞縱軸相互平行排列(圖1)。傳代細(xì)胞24h內(nèi)完全貼壁，3～4d細(xì)胞達(dá)到完全融合，呈均勻一致的紡錘形。

2.2流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果

所培養(yǎng)的第3代細(xì)胞高表達(dá)表面標(biāo)志分子CD34、CD90、及CD106陽性率分別為95.26%、99.48%、77.12%，而極低表達(dá)造血細(xì)胞表面分子:CD45、CD34、CD11b陽性率分別為1.94%、0.02%、1.43%，證明所分離培養(yǎng)的細(xì)胞為MSCs，而非造血干細(xì)胞(圖2)。

2.3GFP在lenti-bFGF-GFP轉(zhuǎn)染的MSC中的表達(dá)

以MOI為10、30和50的lenti-bFGF-GFP分別轉(zhuǎn)染MSC后24h，即可見綠色熒光，72h后綠色熒光呈全細(xì)胞分布，MOI 為10、30、50是轉(zhuǎn)染效率分別為36.6%、84.2%、98.5%(圖3)，轉(zhuǎn)染后20d仍可見綠色熒光。隨轉(zhuǎn)染滴度的增加，熒光強度也逐漸增強，其中MOI為50時，綠色熒光最強而且細(xì)胞未出現(xiàn)明顯病態(tài)現(xiàn)象。結(jié)果表明慢病毒可將bFGF和GFP基因成功轉(zhuǎn)染到MSCs內(nèi)，且MOI為50時，BMSCs的慢病毒轉(zhuǎn)染率超過了85.0%，可滿足試驗需求。

2.4ELISA檢測目的蛋白bFGF的表達(dá)

bFGF -GFP-BMSCs組與2對照組相比顯現(xiàn)陽性結(jié)果。見表1。

2.5RT-PCR檢測目的基因bFGF的表達(dá)

三組細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)72h后，紫外分光光度計上測定OD260/OD280的值均在1.8～2.1。RT-PCR經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳示:以100bp-600bp DNA ladder的marker為標(biāo)志，于234bp、 348bp處可見擴增產(chǎn)物條帶，分別為bFGF及β-action內(nèi)參基因片段。兩基因的RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶的位置與理論值相符(圖4)。bFGF-GFP-BMSCs組的bFGF mRNA表達(dá)明顯增高，GFP-BMSCs組(空載體組)和BMSCs組(空白組)mRNA表達(dá)不明顯。

3討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多能干細(xì)胞，具有獲取方便、來源豐富、不涉及倫理道德問題，在宿主組織中可長期存活并整合，可自體移植，無免疫排斥的問題，體外培養(yǎng)擴增快速。有實驗證實，MSCs在體內(nèi)外均可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞[5，6]。MSCs現(xiàn)已成為基因轉(zhuǎn)染治療脊髓損傷的首選載體[7]，其移植可以在損傷脊髓中存活、發(fā)育、生長、分化并形成神經(jīng)連接促進(jìn)功能恢復(fù)[8]，大量試驗已證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷具有良好的效果[9-10]。本實驗以MSCs作為基因轉(zhuǎn)染的目的細(xì)胞，不僅獲得很高的轉(zhuǎn)染率及在體外連續(xù)培養(yǎng)多代均保持對轉(zhuǎn)染基因的穩(wěn)定表達(dá)，而且為后期體內(nèi)移植治療脊髓損傷提供了理想的種子細(xì)胞。

慢病毒載體能感染分裂期及非分裂期細(xì)胞，能使目的基因整合至靶細(xì)胞基因組從而實現(xiàn)長期表達(dá);轉(zhuǎn)移的基因片段容量大;可向同一細(xì)胞引入多種不同的基因，或?qū)ν患?xì)胞反復(fù)感染;不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，其生物安全性也得以大幅提高[11]。bFGF不僅參與神經(jīng)組織的修復(fù)，而且對損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[12]。脊髓損傷后，蛋白激酶被激活，破壞細(xì)胞骨架，造成膜損傷及最終的細(xì)胞溶解死亡，而bFGF可防止或抑制細(xì)胞內(nèi)Ca濃度升高，維持Ca穩(wěn)定，保護(hù)神經(jīng)元免受興奮性氨基酸的毒性作用[13]。Mocchetti等[14]在大鼠脊髓挫傷模型中檢測出bFGF的升高，其變化以傷后4d最明顯，表明脊髓損傷后增多的bFGF具有生物學(xué)活性。Lee等[15]的研究表明，bFGF比其他神經(jīng)營養(yǎng)因子的神經(jīng)保護(hù)作用更大，成年鼠脊髓挫傷后，持續(xù)髓內(nèi)灌注bFGF，脊髓的完全及不完全損傷區(qū)明顯減少，提示bFGF在脊髓損傷方面起非常重要的作用。本實驗中，我們用帶有GFP和bFGF基因的慢病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的大鼠骨髓MSCs，GFP報告基因的表達(dá)產(chǎn)物帶有天然的熒光，這樣無論是體外基因轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)染細(xì)胞體內(nèi)移植后，都可以非常直觀的利用熒光顯微鏡觀察目的蛋白的表達(dá)位置和情況。通過觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞相應(yīng)熒光的有無及強弱，即可判斷對目的基因的表達(dá)情況，而無需繁瑣的鑒定。

本實驗利用慢病毒載體將bFGF基因?qū)氪笫驧SCs內(nèi)，以細(xì)胞作為bFGF的發(fā)生器，經(jīng)ELISA檢測到轉(zhuǎn)染72h后的MSCs內(nèi)bFGF呈持續(xù)高水平表達(dá)，與空載體組和空白組比較具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，而對照組之間無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。RT-PCR檢測實驗組在mRNA水平的表達(dá)情況亦有類似結(jié)果:bFGF-GFP -BMSCs組mRNA較對照組顯著減少，而2個對照組間比較無明顯差別，說明帶有目的基因的慢病毒，不論是在mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平都顯著提高bFGF的表達(dá)。

本實驗采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法相對簡單，轉(zhuǎn)染72h后即可進(jìn)行檢測，隨著細(xì)胞的傳代，目的基因能過穩(wěn)定的遺傳給下一代。通過本實驗，我們獲得可以穩(wěn)定表達(dá)人bFGF基因并攜帶熒光蛋白標(biāo)記的MSCs，這為下一步的動物移植治療脊髓損傷奠定了基礎(chǔ)。

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(收稿日期:2009-11-06)