香煙煙霧對人支氣管上皮細胞氧化應激作用研究

Cigarette Smoke Cause Oxidative Stress on Human Bronchial Epithelial Cells

ZHOU WenquLI BingHONG Wei

Experiment Medical Research Center，Guangzhou Medical College，Guangzhou 510000，China

[Abstract] Objective Observe if cigarette smoke which can be inhaled and deposit in respiratory tract caused oxidative stress on human bronchial epithelial cells. Methods Burning a well-known brand cigarette in a huge glass box，when cigarette smoke form， collected the smoke with a six stage，FA-1-type cascade impactor，got six different sizes particles of cigarette smoke，add different sizes particles of cigarette smoke to human bronchial epithelial cells(16HBE). Detecting reactive oxygen in 16HBE cells by fluorescence probe 6 hours later. Results Cigarette smoke particles obviously increased reactive oxygen in human bronchial epithelial cells compare with no cigarette smoke stimulated group.In different size Cigarette smoke particles， cigarette smoke particles at fourth stage(2.1～3.3μm) caused more oxidative stress in six stages. Cigarette smoke particles at sixth stage(0.65～1.1μm) directly damage human bronchial epithelial cells. Conclusion Cigarette smoke which can be inhaled and deposit in respiratory tract cause oxidative damage on human bronchial epithelial cells and can also cause direct damage on human bronchial epithelial cells.

[Key words] Cigarette smoke;Particle;Oxidative stress

[摘要] 目的 觀察香煙形成的可吸入并沉積在呼吸道的香煙煙霧是否對人支氣管上皮細胞造成的氧化應激。方法 用FA-1型多級撞擊式空氣采樣器對形成的煙霧進行采樣，收集到6種大小不同的香煙煙霧顆粒，將采得的不同大小的香煙煙霧顆粒分別對人支氣管上皮細胞(16HBE)進行刺激。6h后用熒光探針檢測16HBE細胞中的活性氧。結果 與未加香煙煙霧顆粒刺激對照組比較，香煙煙霧顆粒明顯造成人支氣管上皮細胞中活性氧增加。不同大小香煙煙霧顆粒中，第四級(2.1～3.3μm)的香煙煙霧顆粒造成的氧化應激最明顯。第六級(0.65～1.1μm)大小的顆粒能直接對人支氣管上皮細胞造成損傷。結論 可吸入并沉積在呼吸道中的香煙煙霧能造成呼吸道上皮細胞的氧化損傷。也能對呼吸道上皮細胞造成直接損傷。

[關鍵詞] 香煙煙霧;顆粒;氧化應激

[中圖分類號] R361.3[文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)06-24-02

香煙是導致慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺癌等疾病的主要元兇之一[1]，香煙中含有4700多種化學物質，包括多種氧化劑、自中基及半醌基，這些化學物質打破了機體氧化抗氧化的平衡并能在肺中導致細胞內的損傷，首當其沖受損的是氣道上皮細胞[3]。

香煙燃燒后的香煙煙霧是以氣溶膠形式存在空氣中，氣溶膠是空氣中懸浮的固態或液態顆粒的總稱，5～10μm直徑大小的氣溶膠顆粒能在空氣中停留較長時間，進入人的呼吸系統[4]。通過FA-1型空氣采樣器能收集能進入并沉積在呼吸道的香煙顆粒，通過熒光探針檢測細胞內的活性氧，觀察香煙煙霧顆粒對支氣管上皮細胞的氧化作用。

1材料與方法

1.1材料

主要儀器有FA-1型多級撞擊式空氣采樣器(遼陽市康潔儀器研究所)，LEICA DM IRBE倒置熒光生物顯微鏡，鋼化玻璃箱(容積為100cm×50cm×50cm，內置紫外燈)。所用香煙為國內知名品牌“大前門”香煙。主要試劑DMEM細胞培養基，熒光素5-(and-6)-carboxy-2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(carboxy-H2DCFDA)均購自invitation公司。細胞培養皿為corning公司。

1.2方法

1.2.1采樣將6個含有3mL DMEM培養液的100mm×20mm大小的細胞培養皿依次放入FA-1型多級撞擊式空氣采樣器中，將空氣采樣器置于250L鋼化玻璃箱內，箱內空氣紫外線消毒30min，通氣1h后燃燒1支香煙。待煙霧擴散后，啟動采樣器，各級采集樣品，采樣流量為28.3L/min，采樣時間為9min。香煙煙霧顆粒被采集到采樣器內6個平皿中的DMEM培養基中。采樣器收集到的6級顆粒由第1級至第6級大小分別為>7.0m，4.7～7.0μm，3.3～4.7μm，2.1～3.3μm，1.1～2.1μm 以及0.65～1.1μm。

1.2.2細胞刺激將收集到香煙氣溶膠顆粒的6個平皿中的DMEM培養基分別加入鋪滿人支氣管上皮細胞16HBE的3個6孔板中，每個平皿中的3mL DMEM培養基加入3個平行孔各1mL。同是另一鋪滿細胞的6孔板中加入無香煙顆粒的DMEM培養基作為陰性對照，將6孔板置于溫度37℃、5%CO2濃度的培養箱中，6h后取出，傾去培養液，HBSS液洗兩遍，用含5μmol carboxy-H2DCFDA的HBSS液37℃處理40min。然后用HBSS液洗3遍，每孔加入1mL DMEM培養基于熒光倒置顯微鏡下觀察。本實驗重復3次。

2結果

2.1顆粒分布

收集到的6種大小香煙顆粒的含DMEM平皿中，第6級收集到的可見香煙顆粒最多(0.65～1.1μm)，第5級收集到的可見顆粒(1.1～2.1μm)則其次。其他級別未見明顯可見顆粒。

2.2細胞形態

在陰性對照的孔板中，光鏡下支氣管上皮細胞形態完好，死亡細胞很少，在加入1～5級香煙顆粒的孔板中，細胞形態變化不大，死亡細胞液比較少，在加入第6級香煙顆粒的孔板中，由于該級別收到的顆粒較多，有較多細胞死亡。在熒光顯微鏡下可見許多死細胞產生的背景熒光。

2.3細胞內活性氧觀察

在陰性對照的孔板中，幾乎觀察不到綠色熒光，細胞氧化應激非常低，與陰性對照比較，如封三圖7所見。加入多級空氣采樣器收集到6種大小香煙煙霧顆粒的DMEM的孔板中，熒光顯微鏡下各級均能觀察到H2DCFDA進入細胞后能氧化分解為DCF顯示的綠色熒光，尤以第4級(2.1～3.3μm)綠色熒光最強。第3級(3.3～4.7μm)。其次，第6級(0.7～1.1μm)中有許多死細胞產生的背景熒光。

3討論

吸煙與呼吸系統多種腫瘤和疾病發生有一定關聯，但至今人們對吸煙的致病機制仍不是很清楚。氧化應激導致的損傷被認為可能是香煙引起呼吸系統疾病的重要因素，以往研究者進行香煙煙霧研究時，直接收集所有煙霧，并將>0.22μm顆粒物過濾掉[5-7]，因而忽略香煙煙霧中固體顆粒物對呼吸系統的影響。香煙煙霧中既有固體成分，也有液體成分，本實驗創新性地采用空氣收集器對煙霧進行全面收集。極大顆粒的煙霧將向地面下沉，極小顆粒吸入呼吸道后將呼出呼吸道，只有大小合適的煙霧才可以被吸入并沉積在呼吸道中，對人的呼吸道造成損傷，本研究中采用的國際通用類似安德森采樣器的空氣采集器是一種分級采集方式，即利用碰撞采樣器把不同粒度的氣溶膠分別采集在不同的容器上[8]，只對可沉積在人呼吸道的香煙煙霧顆粒進行分大小收集，并將其對人支氣管上皮細胞進行刺激。結果發現，第6級(0.7～1.1μm)和第5級(1.1～2.1μm)收集到得可見顆粒較多，說明香煙煙霧中的可沉積在呼吸道內的固體成分集中在0.7～2.1μm大小，其他級別未見明顯可見顆粒，但煙味很濃，可能以焦油等液體成分為主。實驗中收集到的各級香煙煙霧的顆粒均可對人支氣管上皮細胞造成氧化刺激，收集器1~3級是大部分進入上呼吸道的香煙煙霧，4～6級大部分是則進入下呼吸道的香煙煙霧，從實驗結果可以看出，第4級(2.1～3.3μm)顆粒大小的香煙顆粒造成的氧化應激更為嚴重，香煙中的氧化劑可進一步促使吸煙者炎癥細胞如中性粒細胞和巨噬細胞遷移入肺內并釋放氧自由基。對肺造成進一步損傷[9]。第6級(0.7～1.1μm)收集到的香煙煙霧可見顆粒最多，不但對人支氣管上皮細胞造成氧化應激，而且直接造成了嚴重損傷，導致大量細胞死亡，死亡的細胞發出黃綠色熒光，與DCF所發熒光相比較暗，可見除香煙提取物可造成氧化應激以及細胞造成損傷外，香煙顆粒對細胞可以產生直接的損傷，以往研究均以香煙煙霧提取物進行實驗忽略了香煙顆粒對氣道產生的直接損傷，但從本實驗結果看，顆粒物造成的直接損傷也在香煙對呼吸道上皮細胞的傷害中起著重要作用。香煙煙霧顆粒物對呼吸道的直接和間接損傷使得香煙煙霧對下呼吸道的損傷更為嚴重，吸煙被認為是慢性阻塞性肺疾病(COPD)發病的重要因素，小氣道阻塞常見于COPD患者，香煙煙霧對小氣道的損害應該是COPD發病的重要原因之一。香煙煙霧對氣道損傷反應的深入研究有助于進一步認識呼吸道疾病的發生發展，以便更好地對疾病治療和預防，也為我們以后研究香煙的致病機制提供了依據。

[參考文獻]

[1] Church DF，Pryor WA. Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications[J]. Environ Health Perspect，1985，64:111 -126.

[2] Kirkham P， Rahman I. Oxidative stress in asthma and COPD:Antioxidants as a therapeutic strategy[J]. Pharmacol Ther，2006，111:476-494.

[3] Rahman I，Biswas SK，Kode A. Oxidant and antioxidant balance in the airways and airway diseases[J]. Eur J Pharmacol，2006，533:222- 239.

[4] Nicas M，Nazaroff W，Hubbard A. Toward understanding the risk of secondary airborne infection: emission of respirable pathogens[J]. J Occup Environyg，2005，2:143-154.

[5] Luppi F，Aarbiou J，van Wetering S，et al. Effects of cigarette smoke condensate on proliferation and wound closure of bronchial epithelial cells in vitro:role of glutathione[J]. Respir Res，2005，6:140.

[6] Aruna Kode，Se-Ran Yang and Irfan Rahman. Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airwayepithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells[J]. Respir Res，2006，7:132.

[7] 付強，成靜，韓中博，等. 香煙煙霧提取物對人呼吸道上皮細胞DNA損傷和凋亡的影響[J]. 癌癥，2006，25(10):1191-1197.

[8] Yabuki S，Kanayama S，Fu F，et a1. Aeolian Dust Experiment on Climate Impact. Physical and Chemical Characteristics of Aeolian Dust Collected Over Asian Dust Source Regions in China-Comparison with Atmospheric Aerosols in an Urban Area at Wako， Japan[J]. Journal of Arid Land Studies，2002，11:273-289.

[9] Morrison D， Rahman I， Lannan S，et al. Epithelial permeability，inflammation，and oxidant stress in the air spaces of smokers[J]. Am J Respir Critare，1999，159:473-479.

(收稿日期:2009-11-30)