大鼠腦缺血再灌注損傷后尼莫地平對神經細胞凋亡影響的研究

[摘要] 目的 研究大鼠腦缺血再灌注后尼莫地平對神經細胞凋亡的影響。方法雄性Wistar大鼠120只，隨機分為空白對照組、假手術組、腦缺血組和尼莫地平組，后兩組按時間分成再灌注1、3、6、12、24、36、48、72h和7d組。制作MACO動物模型致大鼠形成局灶性腦缺血，記錄大鼠的神經功能缺損情況，應用TUNEL法檢測腦缺血再灌注后神經細胞凋亡的情況。結果大鼠腦缺血再灌注后神經細胞凋亡缺血組各時間點同正常對照組、假手術組相比均明顯增高，且差異有統計學意義(P<0.05);尼莫地平干預后可以顯著減少大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡細胞數量(P<0.05)。結論 尼莫地平可以減少神經細胞凋亡，從而保護大鼠腦缺血再灌注后腦細胞的損害。

[關鍵詞] 大鼠腦缺血再灌注;尼莫地平;細胞凋亡

[中圖分類號] R36;R743.3[文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)06-01-02

Effect of Nimodipine on Neuron Apoptosis Following Cerebral Ischemia -reperfusion in Rats

CHENG Jingli1HE Jiling1GENG Hong2SUN Hongying1 YANG Guoan1WU Lie1MA Junbing2

1.Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou 014010，China; 2.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou 014010，China; 3.Central laboratory，the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou 014010，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of nimodipine on neuron apoptosis in the MCAO rat models of focal cerebral ischemia-reperfusion. Methods One hundred and twenty male Wistar rats weighing 250~300g were randomly divided into four groups:normal group，sham operation group， cerebral ischemic group and nimodipine intervention group. Cerebral ischemic and nimodipine intervention groups were further divided into 1-，3-，6-，12-，24-，36-，48-，72h- and 7d- groups according to the different reperfusion time after cerebral ischemia respectively. The MACO rat model of focal cerebral ischemia was produced，rat neurological deficit was recorded and neuron apoptosis following cerebral ischemia-reperfusion was detected by using TUNEL assay. Results The number of neuron apoptosis in the cerebral ischemic group at different time points was significantly increased compared with the sham operation and normal groups， with a significant difference(P<0.05). The number of neuron apoptosis was significantly decreased after nimodipine intervention(P<0.05). Conclusion Nimodipine may inhibit the development of neuron apoptosis in rats after cerebral ischemia-reperfusion and has an neuroprotective effect on the cerebral cells after ischemia-reperfusion injury.

[Key words] Cerebral ischemia-reperfusion;Nimodipine;Neuron apoptosis

細胞凋亡是一種區別于細胞壞死的形態學改變。近年研究表明，細胞凋亡在腦缺血再灌注損傷的形成過程中扮演著重要的角色。細胞凋亡的進一步研究對臨床上腦梗死形成的機制以及治療都將具有很大的意義，現報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物及分組健康雄性Wistar大鼠120只，體重250 ～300g，由內蒙古大學動物實驗中心提供。實驗動物分為空白對照組、假手術組、腦缺血組和尼莫地平組，后兩組按缺血再灌注不同時間點分為缺血2h再灌注1、3、6、12、24、36、48、72h和7d 9個亞組，假手術組取24h，以上共計20組，保證每組6只。

1.1.2試劑及藥品細胞凋亡原位檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)，尼莫地平注射液20mL/4mg(濟南利民制藥有限責任公司)。

1.2 方法

1.2.1模型制備本實驗采用改良的可逆性大腦中動脈線栓法，即Zea longa[1]法。從明確栓線堵塞大腦中動脈起始端開始計時，2h后即將栓線抽出即可使血液再通，形成再灌注模型。假手術組栓線不閉塞大腦中動脈，正常組大鼠不做任何處理。全部大鼠均栓塞右側大腦中動脈(RMCA)。尼莫地平治療組在大鼠再灌注同時給予腹腔注射尼莫地平注射液(批號:07085069)2mg/kg(1mL/100g)1次。缺血組、正常對照組及假手術組無藥物干預處理。

1.2.2組織標本的制備各組大鼠分別于缺血再灌注后各時間點經心臟灌注取腦，于視交叉后2mm處取5mm厚組織，置于4%多聚甲醛液中固定24h。常規脫水、石蠟包埋，冠狀面連續切片，厚度約4μm，分別行HE染色、神經細胞TUNEL染色。

1.2.3神經細胞凋亡的檢測具體步驟按試劑盒說明書進行，陽性對照是在蛋白酶K處理后，加入 DNase I反應液;陰性對照是在制備TdT酶反應液時不添加TdT酶，余步驟相同。在光學顯微鏡下觀察大鼠腦內缺血區凋亡細胞的形態及分布特征，分析方法同上。

1.3統計學處理

各組實驗數據采用均數±標準差(χ±s)表示，應用SPSS13.0統計軟件包進行處理，多個樣本均數的比較采用單因素方差分析和Kruskal-Wills H檢驗。P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1細胞凋亡檢測及圖像分析

結果表明，TUNEL陽性染色為細胞核呈棕黃色顆粒，主要見于梗死灶周圍半暗帶區，假手術組、正常對照組偶見數個陽性細胞。在缺血半暗帶缺血組大鼠再灌注1h僅見少許陽性細胞，隨再灌注時間延長，3h開始升高，于36h明顯增多并維持至48h，到再灌注后72h凋亡陽性細胞的數量開始下降。缺血組各時間點(1h～7d)同正常對照組相比有顯著性差異(P<0.01)。缺血組各時間點(1h～7d)同假手術組相比差異極顯著(P<0.01)。見表1。

2.2腦缺血再灌注后尼莫地平對于神經細胞凋亡的影響

尼莫地平干預后可以顯著減少大鼠腦缺血再灌注損傷后凋亡細胞數量(封三圖1～4)，與缺血組比較，再灌注后6h開始到7d大鼠腦內凋亡細胞數量明顯減少(P<0.05)。見表2。

3討論

細胞凋亡是一種受基因調控的自主性程序性細胞死亡過程，是腦缺血再灌注損傷后細胞死亡的的主要表現形式之一。劉斌等[2]對大鼠腦缺血再灌注后細胞凋亡研究發現，于再灌注1h皮質缺血區已出現凋亡陽性細胞，24～48h達高峰，72h后開始下降，這種時程效應與腦缺血再灌注后的病理變化相對應。目前關于腦缺血再灌注后細胞凋亡出現的時間結果尚有差異，可能與選用的動物、觀察的部位以及缺血程度的輕重有關。本研究結果顯示，缺血組大鼠再灌注1h僅見少許陽性細胞，隨再灌注時間延長，3h開始升高，于36h明顯增多并維持至48h，到再灌注后72h凋亡陽性細胞的數量開始下降。

尼莫地平是二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，呈脂溶性，易透過血腦屏障進入腦組織。它能阻滯Ca2+跨膜內流，并抑制細胞內Ca2+的釋放，使細胞內的Ca2+濃度保持在一定的水平。近年來研究發現，鈣離子在細胞凋亡發生過程中有重要的作用，缺血缺氧性腦損傷時神經元內出現鈣超載并發生凋亡[3，4]，楊光田等[5[研究表明腦缺血再灌注后腦組織Ca2+聚集增加可促進腦細胞凋亡。本研究結果顯示，尼莫地平可明顯抑制神經細胞凋亡，其機制可能為調節Ca2+的細胞內流量，增強線粒體和內質網等鈣庫的攝取和儲存鈣作用，從而降低神經細胞鈣超載，保護腦組織，減輕腦缺血再灌注時的腦損傷，提高神經元對缺血缺氧的耐受性。

對腦缺血再灌注損傷的不同時間點神經細胞凋亡的研究為腦缺血形成機制提供了實驗依據，采取有效的干預措施，盡早抑制細胞凋亡，從而減輕缺血再灌注后的腦組織病理損害。本研究進一步探討了尼莫地平對于腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡的影響，提示尼莫地平對腦缺血神經細胞具有保護作用，其機制可能與抑制細胞凋亡有關，但尼莫地平保護腦缺血后神經元的其他機理有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke，1989，20(1):84-91.

[2] 劉斌，張強，張宇，等. 腦缺血再灌注后不同時間點病理變化與細胞凋亡的研究[J]. 陜西醫學雜志，2007，36(4):395-397.

[3] 趙慶平，鄒飛，陳光忠，等. N甲基D天門冬氨酸受體介導缺氧SD大鼠PO/AH區神經元Ca2+濃度的變化[J]. 第一軍醫大學學報，2004，24(4):461-465.

[4] 李峰，謝瑤，馮志博，等. 低氧與缺血誘導培養海馬和皮質神經元鈣應答反應的比較[J]. 解剖學雜志，2001，24(6):504-509.

[5] 楊光田，陳齊國，湯彥. 一氧化氮和Ca2+含量對缺血再灌注大鼠腦細胞凋亡的影響[J]. 微循環學雜志，2005，15(3):5-7.

(收稿日期:2009-07-13)