二肽對豬卵母細胞體外成熟、受精及胚胎發育的影響

喬德瑞，張曉雋

（1.晉中職業技術學院，山西晉中 030600；2.河南六和飼料有限公司，河南焦作 454350）

豬卵母細胞的體外成熟和體外受精已被廣泛研究。卵母細胞成熟是體外生產系統中的關鍵步驟，它可以影響細胞質量，進而影響胎兒發育和后代健康。但體外成熟的卵母細胞與體內成熟的卵母細胞相比，發育能力下降，表明體外成熟的卵母細胞仍處于次優狀態。因此，對培養基進行一定的改善有助于提高卵母細胞體外成熟效率。氨基酸在大多數卵細胞成熟和胚胎培養的培養基中均有添加，因為它們具有多種生理功能，包括蛋白質和核苷酸的合成能源供應，抗滲透休克、氧化應激，pH 調節（Lane，2011）。氨基酸，尤其是谷氨酰胺的自發降解和分解代謝可導致氨的產生，這對活細胞在體內和體外都有毒（沈偉濤和魏婷，2018）。培養基中氨的存在導致細胞內pH 降低，減少氧化磷酸化和囊胚細胞數，最終改變胎兒發育和增長率（Zander 等，2006）。通過在培養基中添加二肽直接供哺乳動物細胞體外使用可避免谷氨酰胺的毒性作用，有研究表明，谷氨酰胺可以被L- 丙氨酰-L- 谷氨酰胺和L- 甘氨酰-L-谷氨酰胺取代，以達到小鼠胚胎發育水平的提高（Biggers，2004）。二肽在卵母細胞成熟和豬精子頂體反應中起重要作用（Tareq 等，2008）。雖然上述研究報道了二肽在胚胎發育中的重要性，但關于二肽（如甘氨酰谷氨酰胺或丙氨酰谷氨酰胺）對離體豬胚胎發育的直接影響數據有限。因此，本研究旨在探討單獨的二肽或聯合使用對豬卵母細胞離體成熟、受精和發育及對培養基中氨積累的影響。

1 材料與方法

1.1 卵母細胞的恢復和體外成熟 從當地屠宰場收集母豬卵巢，收集后1 ～3 h 于30 ～35℃條件下補充100 IU/mL 青霉素和100 mg/mL 硫酸鏈霉素的生理鹽水保存。參考劉曉鵬和王華巖（2016）的研究方法分離、收集及培養卵母細胞。在豬胚胎細胞培養液中用不同濃度的氨基酸及二肽組合處理胚胎，對照組為基礎培養液，T1 ～T6組分別做如下處理：T1 組添加1 mmol 谷氨酰胺、T2 組加入1 mmol 谷氨酸、T3 組加入2 mmol 丙氨酰谷氨酰胺、T4 組加入2 mmol 甘氨酰谷氨酰胺、T5 組2 mmol 丙氨酰谷氨酰胺+2 mmol 甘氨酰谷氨酰胺、T6 組1 mmol 谷氨酰胺+1 mmol 谷氨酸。

1.2 精子準備、體外受精及胚胎細胞數評估 參考Tareq 等（2007）的研究方法進行體外受精。根據Hunter 和Polge（1996）所述的方法評估卵母細胞的減數分裂階段。

1.3 放射性標記葡萄糖的摻入、氧化及氨氮濃度參考Tareq 等（2005）的方法測定培養基中氨氮濃度。放射性底物14C- 葡萄糖的標記、摻入及氧化測定參考Tsujii 等（2009）的研究方法。

1.4 統計分析 卵母細胞隨機分布于各組，每組5 個重復，試驗數據采用SAS 軟件單因素方差統計模型，采用Duncan’s 法進行多重比較，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 二肽對豬卵母細胞成熟和受精率的影響由表1 可知，卵母細胞分裂中期成熟率及單精受精卵和精原細胞受精率在丙氨酰谷氨酰胺組、甘氨酰谷氨酰胺組及丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺組表現最高（P ＜0.05）。與丙氨酰谷氨酰胺或甘氨酰谷氨酰胺單獨使用相比，聯合使用組顯著提高了卵母細胞分裂中期成熟率、單精受精卵和精原細胞受精率（P ＜0.05）。

2.2 二肽對豬卵母細胞成熟的影響 由表2 可知，聯合使用丙氨酰谷氨酰胺和甘氨酰谷氨酰胺顯著提高了卵母細胞成熟和14C- 葡萄糖的摻入和氧化（P ＜0.05），而對照組與谷氨酰胺、谷氨酸及聯合使用谷氨酰胺和谷氨酸對卵母細胞成熟指標的影響無顯著差異（P ＞0.05）。此外丙氨酰谷氨酰胺和甘氨酰谷氨酰胺聯合使用組卵母細胞成熟與受精過程中培養液氨氮濃度表現最低（P＜0.05）。

2.3 二肽對卵母細胞胚胎發育及胚胎14C- 葡萄糖摻入、氧化及氨氮濃度的影響 由表3 可知，丙氨酰谷氨酰胺、甘氨酰谷氨酰胺及丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺組胚胎發育2 ～4 個、8 ～16 個及桑椹胚和囊胚數顯著高于其他組（P＜0.05），同時丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺組胚胎發育2 ～4 個、8 ～16 個及桑椹胚和囊胚數顯著高于丙氨酰谷氨酰胺和甘氨酰谷氨酰胺組（P ＜0.05）。

由表4 可知，丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺組2 細胞和囊胚14C- 葡萄糖摻入、氧化量顯著高于對照組，而氨氮濃度顯著低于對照組（P ＜0.05）。

表1 二肽對豬卵母細胞成熟和受精率的影響

表2 二肽對豬卵母細胞成熟和受精過程14C- 葡萄糖摻入、氧化及氨氮濃度的影響

表3 二肽對豬卵母細胞胚胎發育的影響

2.4 二肽對囊胚細胞數量的影響 由表5 可知，丙氨酰谷氨酰胺、甘氨酰谷氨酰胺及丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺組內細胞團數和滋養外胚層細胞數顯著高于對照組（P ＜0.05），同時丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺組內細胞團數和滋養外胚層細胞數顯著高于其他各組（P ＜0.05）。

表4 二肽對豬卵母細胞胚胎14C-葡萄糖摻入、氧化及氨氮濃度的影響

表5 二肽對囊胚細胞數量的影響

3 討論

本試驗發現，聯合使用丙氨酰谷氨酰胺和甘氨酰谷氨酰胺使卵母細胞成熟、授精和胚泡階段氨氮濃度較對照組分別降低了120、70 和100 μmol，其中本研究中氨基酸和二肽的最佳濃度與豬卵母細胞和精子的最佳濃度相似（Tareq 等，2008）。這些結果表明，對氨的敏感性取決于卵母細胞或胚胎的發育階段，可能與卵丘細胞的存在有關。Yuan 和Krisher（2010）提出，氨對卵母細胞分離中期有不利影響，而氨是卵母細胞在體外成熟過程中產生的。卵母細胞在體外培養過程中卵丘細胞起至關重要的作用，因為卵丘細胞的體外生長和代謝受類似于卵泡液中氨濃度的改變，這些卵丘細胞支持卵母細胞體外成熟的能力受到損害。另外，卵丘細胞可以減少卵母細胞直接接觸到氨的量，阻止培養基中的氨通過縫隙連接轉運到卵母細胞（Tareq 等，2007）。本數據表明，丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺的添加對培養基中卵母細胞分離中期、單精受精卵和精原細胞形成、成熟和受精的影響最大。

體外研究證明，氨基酸在體內支持正常的著床前發育。氨基酸的自然降解和分解會形成吡咯烷酮碳酸和潛在的有害氨。氨對活細胞的毒性在體內外都是公認的。具體來說，氨含量的增加降低了pH，增加了滲透壓，導致精子活力逐漸喪失，并降低了豬卵母細胞分裂中期和單精受精的速率（Tareq 等，2007）。本試驗結果表明，與其他處理組相比，丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺處理減少了氨的積累，對卵母細胞成熟、受精和發育成囊胚方面有重要作用。

一些研究已經證明，哺乳動物葡萄糖代謝對植入前胚胎的影響，對豬胚胎的營養攝取研究表明，胚胎在發育的所有階段都消耗葡萄糖并產生乳酸。因此，含葡萄糖的培養基常被用于體外培養豬胚胎。葡萄糖的結合和氧化是卵母細胞活力和產生卵子的指標（Tsujii 等，2009）。本研究丙氨酰谷氨酰胺+ 甘氨酰谷氨酰胺處理的卵母細胞在成熟、受精、細胞和囊胚階段的14C 標記葡萄糖的摻入率和氧化率明顯高于對照組，這與Tareq等（2012）的研究結果一致。因此，在胚胎發育階段，當胚胎對能量的需求較高時，培養基中的高氨氮可能會降低胚胎細胞對ATP 的可利用性，導致退化卵增多，囊胚發育階段減少。但丙氨酰谷氨酰胺+甘氨酰谷氨酰胺產生的內細胞團和滋養外層細胞數量的顯著增加，表明丙氨酸和甘氨酸是通過一種未知的機制起主要作用（Tareq 等，2012）。

4 結論

本研究結果表明，二肽參與調控豬卵母細胞的成熟、受精和胚胎發育，其中將丙氨酰谷氨酰胺和甘氨酰谷氨酰胺結合可以降低氨積累，提高豬胚胎細胞成熟、受精、胚胎發育和葡萄糖的攝入速度。