野生與栽培地骨皮藥材HPLC指紋圖譜的研究

劉 偉， 郭 蕾， 崔永霞， 陳志紅， 龔海燕

(河南中醫(yī)學(xué)院分析測試中心，河南鄭州450008)

地骨皮為茄科植物枸杞(Lycium chinense Mill.)或?qū)幭蔫坭?Lycium barbarum L.)的干燥根皮［1］。具有涼血除蒸，清肺降火之功效，具有陰虛潮熱、骨蒸盜汗、肺熱咳嗽、咯血、衄血［2］作用，地骨皮含東莨菪內(nèi)酯，香草酸，甜菜堿等成分［3-4］，為臨床常用中藥。目前，關(guān)于地骨皮藥材質(zhì)量分析報道不多，本試驗采用反相高效液相色譜，梯度洗脫，對采自河南，寧夏，甘肅等產(chǎn)地的14批野生和栽培地骨皮藥材進(jìn)行了指紋圖譜分析研究，以期為進(jìn)一步完善該藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗依據(jù)。

1 儀器、試劑和樣品

DIONEX Summit系統(tǒng)高效液相色譜儀，F(xiàn)A2004A萬分之一天平;實(shí)驗所用甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其它試劑均為分析純。相似度評價軟件:中國藥典會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件(A/B版)。所有地骨皮藥材(見表1)均采自于河南等不同省份，其中栽培地骨皮生長年限均為3年，以上樣品由河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院陳隨清教授鑒定為茄科植物枸杞(Lycium chinense Mill.)或?qū)幭蔫坭?Lycium barbarum L.)的干燥根皮。

表1 地骨皮藥材樣品的來源

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 取各批次地骨皮粉末(過四號篩)約2 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液35 mL，蒸干，加甲醇定容至5 mL，經(jīng)微孔濾膜過濾器(0.45 μm)過濾，作為供試品溶液。

2.2 試驗條件的考察

2.2.1 流動相的選擇 本試驗曾選用多種流動相梯度洗脫系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，首先選用了甲醇-水、乙腈-水不同比例變化的梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇-水作為流動相時，色譜峰分離效果比乙腈-水作為流動相峰的分離效果好，且基線較為平穩(wěn)，但是個別峰的分離效果不佳，在水相中加入0.1%的磷酸來調(diào)節(jié)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色譜峰分離改善明顯，各色譜峰的分離效果較好，最后確定流動相洗脫系統(tǒng)為甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)溶液梯度洗脫，并進(jìn)行洗脫條件的優(yōu)選，最后確定最佳梯度洗脫程序:流動相A:0～25 min，13% ～20%;25～60 min，20% ～22%，色譜圖上各色譜峰分離良好，保留時間適中，峰形對稱。

2.2.2 色譜柱選擇 試驗中共考察了3種不同廠家的色譜柱 Dikma Kromasil C18100A，AichromBond-AQ C18及 Agilent TC-C18(均為250 mm×4.6 mm，5 μm)3種型號色譜柱的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dikma Kromasil C18100A，Agilent TC-C18色譜柱分離所得的色譜圖有拖尾現(xiàn)象，且個別峰的分離度較差，而AichromBond-AQ C18色譜柱的分離效果較好，基線平穩(wěn)，且峰形也較為對稱，因此選擇AichromBond-AQ C18色譜柱。

2.2.3 檢測波長的選擇 本試驗采用二極管陣列紫外檢測器作為檢測器，首先在上述色譜條件下采用全波長掃描進(jìn)行測定，并同時在200～400 nm下采集其三維色譜圖，通過對三維色譜圖在所有波長下的出峰的情況、基線的平穩(wěn)程度，以及各成分的分離情況等綜合考慮，最終選定檢測波長為315 nm。

2.2.4 供試品溶液制備方法的選擇 本試驗曾考察了甲醇，80%甲醇，水，95%乙醇4種提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水作為提取溶劑的樣品溶液所得的供試品峰數(shù)較多，但是雜質(zhì)也很多，很難使每個色譜峰完全分離，最重要的是所得色譜圖特征性不明顯;95%乙醇為提取溶劑的樣品溶液所得色譜峰比80%甲醇和甲醇提取所得的樣品溶液色譜峰少;80%甲醇和甲醇作為提取溶劑所得色譜峰差別不大，但80%甲醇提取色譜峰個別峰分離度較差，因此采用甲醇作為提取溶劑。

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1 色譜條件 AichromBond-AQ C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇-0.1%磷酸水，按“2.2.1”項下選定的條件進(jìn)行梯度洗脫;流速:0.8 mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:315 nm;記錄時間:60 min;進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2 方法學(xué)考察

2.3.2.1 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按照2.3.1項下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄各共有峰保留時間和峰面積，以共有峰的3號峰作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)峰，結(jié)果顯示，共有峰的相對保留時間和相對峰面積積分值的RSD值分別為0.08%～0.77%和0.40% ～2.11%，符合指紋圖譜的要求，表明儀器精密度良好。

2.3.2.2 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品5份，按照2.1項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，記錄各共有峰的保留時間和峰面積。以3號峰作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)峰，結(jié)果顯示，共有峰的相對保留時間和相對峰面積積分值的RSD值分別為0.08%～0.86%和1.72% ～2.81%，符合指紋圖譜要求，表明試驗的重復(fù)性良好。

2.3.2.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液，在相同的條件下分別于0，3，6，9，12，15 h 測定結(jié)果，以3 號峰的保留時間和峰面積值作為參照，共有峰的相對保留時間和相對峰面積積分值的RSD值分別為0.02% ～0.33%和0.33% ～2.93%，符合指紋圖譜要求，表明試液在15 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 樣品測定 取14批供試品，按2.1項下供試品制備方法制備并測定，樣品色譜圖見圖1。以3號峰的保留時間為參照，共有峰的相對保留時間RSD值為0.31% ～0.91%，共有峰面積和大于總峰面積的90%，共有峰的相對峰面積見表2。

圖1 地骨皮樣品色譜圖(2號:甘肅蘭州栽培，8號峰為共有峰3號峰)

表2 各批次藥材共有峰的相對峰面積

3 結(jié)果

3.1 地骨皮樣品共有模式建立 以藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(A版)”對上述14批地骨皮藥材HPLC指紋圖譜進(jìn)行分析，建立了地骨皮藥材的對照指紋圖譜，確定了12個共有峰作為基本特征峰。指紋圖譜匹配結(jié)果見圖2。

3.2 指紋圖譜相似度分析 采用國家藥典委員會的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)對上述14批藥材的指紋圖譜進(jìn)行相似度的分析，相似度計算結(jié)果見表3。試驗分析結(jié)果表明，相似度分析結(jié)果均在0.85以上。

圖2 14批藥材的指紋圖譜

表3 相似度計算結(jié)果

4 討論

4.1 從14批藥材的整體看來，各樣品共有峰的相對保留時間嚴(yán)格一致，各個共有峰的相對峰面積變化趨勢也一致，其相似度在0.85以上，不同產(chǎn)地的地骨皮藥材有比較好的一致性，并且通過方法學(xué)考查試驗驗證，本試驗具有較好的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。因此，該地骨皮指紋圖譜具有專屬性，可以作為地骨皮真?zhèn)魏蛢?yōu)劣鑒定的手段之一，對地骨皮藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。

4.2 本試驗所用野生和栽培地骨皮藥材均采自于全國各地，所得指紋圖譜共有峰相對保留時間RSD值均小于1%，但是共有峰相對峰面積有一定差別，由圖2可知，野生和栽培地骨皮化學(xué)成分種類差別不明顯，但是其化學(xué)成分的含量卻存在較大差異，全國不同區(qū)域，不同來源地骨皮的化學(xué)成分含量差異亦較為明顯，這可能與各藥材來源，產(chǎn)地的土壤氣候條件、種植方法以及采集時間等因素有關(guān)。

4.3 本試驗的14批地骨皮藥材中，在檢出限內(nèi)未檢測出東莨菪內(nèi)酯、香草酸、肉桂酸等成分(東莨菪內(nèi)酯、香草酸、肉桂酸對照品在標(biāo)準(zhǔn)對照色譜指紋圖譜共有峰中未找出其歸屬)。受文獻(xiàn)資料缺乏和儀器條件所限，試驗未能給出部分色譜峰的有效成分歸屬，有待進(jìn)一步研究。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:82.

［2］江蘇新醫(yī)學(xué)院《中藥大辭典》編寫組.中藥大辭典:上冊［M］.上海:上海人民出版社，1997:819.

［3］鄭軍義，趙萬洲.地骨皮的化學(xué)與藥理研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2008，20(5):62-65.

［4］周 潔，朱 偉.地骨皮的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展［J］.山西中醫(yī)，2008，24(2):47-48.