基于ISSR標記的半夏種質資源遺傳多樣性分析

楊 旻， 陳科力

(湖北中醫學院，省部共建中藥資源和中藥復方教育部重點實驗室，湖北武漢430065)

半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.的干燥塊莖，有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結的功效。半夏為我國傳統大宗藥材，近年由于需求增加，野生資源日漸減少，栽培半夏成了主流商品。種質資源是影響農作物產量和質量的一個重要因素，已有文獻對半夏種質資源進行了研究，但尚未對不同類型半夏種質資源建立分子標記鑒定方法［1-3］。

ISSR(簡單序列重復區間擴增多態性，Inter Simple Sequence Repeat)分子標記技術以其簡便迅速、多態性高、重復性好等優點被廣泛應用于動植物的品種鑒定、DNA指紋圖譜構建和生物多樣性研究等領域，在中草藥種內和種間鑒定等方面也得到廣泛運用［4-6］。本實驗采用ISSR方法對不同產地、不同表型的半夏共35份樣品進行研究，構建其DNA指紋圖譜，在分子水平上探討其產地與種質資源遺傳差異的相關性。

1 材料與儀器

1.1 材料 35份半夏樣品按葉片數量和形態進行分類［1］，具體見表1。其中來自河南三門峽、四川南充、江西廬山、湖北荊門、十堰、大悟、襄樊的半夏樣品均為野生品種，余為栽培品種。采樣時采摘半夏的嫩葉，每份樣品由5～10個半夏個體組成，置于盛有硅膠的塑膠袋中干燥保存。

表1 不同表型半夏及其產地Tab.1 Phenotypes and habitats of Pinellia ternata

1.2 試劑與儀器 用于ISSR反應的Taq酶、Mg2+、dNTPs、標準分子量(Marker)100 bp Ladder購自北京Tiangen公司;引物、Sybral Green I購自上海Sangon公司。PCR反應在美國BIO-RAD公司的PTC-0200型PCR儀上進行，擴增結果由北京六一WD-9413A型凝膠成像分析系統檢測。

2 實驗方法

2.1 總DNA提取與濃度測定 采用北京Tiangen公司植物總DNA提取試劑盒提取基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據樣品OD260/OD280分析純度，以1.8左右為宜，根據OD260值計算樣品DNA濃度。

2.2 ISSR擴增及產物檢測 ISSR引物序列參考Univer sity of British Columbia提供的標準序列，通過預實驗從80個引物中篩選出8個能穩定擴增且背景清晰的引物(表2)。ISSR-PCR的最佳反應體系為20 μL反應體系中含有Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 250 μmol/L、引物0.5 μmol/L、Taq DNA 聚合酶1U、20 ng模板DNA、2%甲酰胺。PCR擴增程序為:95℃預變性3 min;94℃變性30 s，Tm℃復性45 s，72℃延伸90 s，35個循環;72℃延伸5 min。

表2 ISSR擴增引物序列及退火溫度Tab.2 Names of ISSR primers，sequence and annealing temperature

擴增反應結束后，PCR產物在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為1×TAE，電壓5 V/cm，電泳結束后在凝膠圖像分析儀上觀測分析并照相。

2.3 數據統計與分析 根據ISSR擴增條帶的有無，分別以1和0表示。在相同遷移位置，有條帶記為1，無條帶記為0。用SPSS15.0計算樣品間的Jaccard相似系數，并進行聚類分析，建立樣品間的親緣關系樹。

3 結果與分析

對表1中35個不同產地及表型的半夏進行ISSR擴增，結果見表3和圖1。Jaccard相似系數矩陣和聚類系統樹見圖2。共擴增出104條帶，其中97條具有多態性，多態位點百分率為93.3%。各引物擴增的條帶數為8～20條，平均擴增條帶數為13.0條。

表3 不同產地及不同表型半夏ISSR擴增結果Tab.3 The ISSR amplified results of Pinellia ternate with different phenotypes and from different habitats

圖1 引物UBC843 ISSR擴增譜帶M.100 bp DNA Ladder1～35代表的物種順序見表1Fig.1 ISSR bands amplified with primer UBC843M.100 bp DNA Ladder，the number of 1 ～35 refers to the spieces listed in Tab.1

圖2 不同產地及不同表型半夏聚類圖Fig.2 Dendrogram of Pinellia ternate with different phenotypes and from different habitats

從Jaccard相似系數矩陣中可知各產地半夏間的相似系數在0.389～0.922之間。聚類圖上顯示產地先于表型聚類在一起，如圖2大致分為4支，A支主要由湖北襄樊樊城區各表型半夏構成，B支由山西運城、四川南充、河南三門峽、陜西商洛和湖北十堰半夏構成，C支由山東高密和湖北襄樊襄陽構成，D支由湖北大悟、荊門和山東臨沂構成。35個樣品中貴陽三葉細葉、三葉闊葉、臨沂三葉闊葉、高密三葉細葉、五葉細葉等5個栽培樣品未按地區聚類，說明栽培樣品的原始種群可能來自于不同地區。若將各野生半夏進行聚類，則能清晰看出它們按產地分為5支，且各地間的遺傳距離較遠，如圖3，①為湖北襄樊樊城區，②為湖北襄樊襄陽區和江西廬山，③為湖北十堰和四川南充，④為河南三門峽和湖北荊門，⑤為湖北大悟。

圖3 不同產地及不同表型野生半夏聚類圖Fig.3 Dendrogram of Pinellia ternate in the wild with different phenotypes and from different habitats

4 討論

4.1 眾多文獻中依據葉型將半夏分為不同類型。我們的ISSR研究結果顯示35個不同表型和產地的半夏居群樣品按產地各自聚為一類，表明地理因素對半夏種質遺傳多樣性的影響較葉形態特征的表型差異更加重要。綜合分析半夏各居群的Jaccard相似系數，可知不同葉型半夏種群間的相似性高，而不同地區間的相似性較低，提示半夏尤其是野生半夏的種質資源群類應以地區劃分為主，表型為輔。相對于野生半夏，栽培半夏聚類較混亂，可能與栽培樣品的種質來源較多有關。例如據我們的調查，山東高密和臨沂的半夏種莖，就來自于湖北和河南兩地。

4.2 產地生態和地理環境是影響藥材質量的一個重要因素，但藥材的產地屬性通常很難確認。本試驗ISSR譜明確顯示絕大部分野生半夏依據不同地區各自聚類，揭示了產地與種質資源類群的聯系。因此，我們可以建立各個地道產地野生半夏的各個序列的ISSR譜系，作為鑒別不同產地野生半夏種質資源的輔助方法。

4.3 ISSR標記結合了SSR標記技術和RAPD標記技術的特點，但比SSR標記更簡便，比RAPD標記更穩定，多態性更高。由于采用了較高的退火溫度，因此ISSR分子標記具有更高的可重復性。本研究擴增得到的半夏ISSR帶型表現出很高的多態性，而且可重復性較好，說明該ISSR分子標記是評估半夏遺傳多樣性的有效方法。通過該研究發現半夏種內不同產地和表型之間具有較高的遺傳多樣性，其中產地差異是造成種質資源多樣性的主要原因，要有效保護半夏的遺傳資源，需要保護盡可能多的居群，尤其是野生居群。

［1］魏淑紅，彭正松.半夏群體性狀變異類型研究［J］.江蘇農業科學，2004，(4):37-39.

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