HPLC測定藍萼香茶菜中齊墩果酸和熊果酸的含量

沈曉丹， 袁 杰， 徐乃玉， 李 寧， 張 健，2*

(1.蘇州大學藥學院，江蘇蘇州215123;2.蘇州利元醫藥科技有限公司，江蘇蘇州215011;3.安徽省食品藥品檢定所，安徽合肥230051)

藍萼香茶菜Rabdosia japonica var.glaucocalyx(Maxin.)Hara為唇形科香茶菜屬植物，為民間藥，性味苦、寒，具有健胃、清熱解毒、活血等功能，用于治療胃炎，脘腹脹痛，肝炎初期，感冒發熱等。藍萼香茶菜葉中主要含有藍萼甲素、藍萼丙素、ent-7β，14α，15β 三羥基-16-貝殼杉烯-3-酮等二萜類成分;木栓酮、乙酰熊果酸、齊墩果酸、熊果酸、2α-羥基熊果酸、2α，3α-二羥基熊果酸等三萜類化合物;及槲皮素、蘆丁等黃酮;β-谷甾醇、胡蘿卜苷、果糖等其它類化合物。張元桐等采用反相HPLC測得藍萼甲素含量為1.03%，但未對三萜類成分-齊墩果酸和熊果酸進行含量測定［1-4］。齊墩果酸和熊果酸具有較強的生理活性，齊墩果酸具有保肝、抗心律失常、降血糖、降血脂、抗高血壓、抗炎、抗病毒、免疫凋節、抑制血小板聚集和抗氧化等多種藥理作用;熊果酸具有鎮靜、抗炎、抗菌、抗糖尿病、降血糖、抑制癌細胞和腫瘤細胞等作用［5-6］;為此，有必要建立該植物的齊墩果酸和熊果酸的質量控制方法。本實驗采用高效液相色譜法建立了同時測定藍萼香茶菜葉中齊墩果酸和熊果酸含量的方法，為進一步有效控制藍萼香茶菜的質量提供依據。

1 儀器與試藥

島津LC20A高效液相色譜儀(二元梯度515泵、智能柱溫箱、紫外可見檢測器SPD-M20A、化學工作站等)。齊墩果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110709-200304，供含量測定用);熊果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110742-200516，供含量測定用);甲醇為色譜純;水為純化水;其余試劑均為分析純;藍萼香茶菜采自黑龍江省鐵力市桃山林業局白河林場(海撥 280.4m;N 46°986′;E128°688′)，經黑龍江中醫藥大學王振月教授鑒定為藍萼香茶菜Rabdosia japonica var.glaucocalyx(Maxin.)Hara;標本保存在黑龍江中醫藥大學標本館。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇 -0.1%磷酸(80∶20);流速:1.0 mL/min;柱溫:35℃;檢測波長:210 nm。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取齊墩果酸、熊果酸對照品，用甲醇超聲溶解配成含0.13 mg/mL齊墩果酸、0.78 mg/mL熊果酸的混合對照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備 精密稱取葉1 g，置于250 mL園底燒瓶，加入25 mL甲醇，回流提取2 h，過濾，回收甲醇，溶解于10 mL水中，石油醚萃取兩次，每次20 mL，水層回收至干，25 mL甲醇溶解，過濾，定容至25 mL量瓶中，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續濾液作為樣品溶液。

2.4 系統適用性試驗 取熊果酸和齊墩果酸對照品溶液、樣品溶液按上述色譜條件，進樣20 μL，測得其 HPLC圖譜，如圖1所示，齊墩果酸和熊果酸的保留時間分別為24.6 min和26.8 min;理論塔板數分別為13 592和12 096;分離度為1.453;符合定量分析的要求。

2.5 線性關系考察 精密量取上述對照品混合溶液0.1、0.3、0.7、1.1、1.5 mL至 5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，各取上述溶液20 μL注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得齊墩果酸線性回歸方程為Y=7 756 267 X+10 973，r=0.999 8;熊果酸線性回歸方程為Y=7 951 888X+17 163，r=0.999 5;表明當齊墩果酸進樣量在2.6～39.0 μg，熊果酸進樣量在 1.6 ～23.4 μg之間時，進樣量與峰面積呈良好的線性關系。

圖1 藍萼香茶菜HPLC圖譜

2.6 精密度實驗 取同一對照品溶液，重復進樣5次，每次20 μL，按上述色譜條件測定齊墩果酸和熊果酸峰面積，計算齊墩果酸峰面積的RSD為1.59%，熊果酸峰面積的RSD為1.69%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性實驗 按2.3項樣品溶液制備方法處理同一樣品5份，各吸取20 μL，按上述色譜條件測定，分別測定齊墩果酸和熊果酸峰面積，計算齊墩果酸峰面積的 RSD為1.52%，熊果酸峰面積的RSD為2.20%，表明實驗方法重復性良好。

2.8 穩定性實驗 取藍萼香茶菜，依2.3項制備供試品溶液，在 0，2，4，8，12，24 h 各吸取 20 μL，按上述色譜條件測定，測得齊墩果酸的峰面積RSD為1.35%，熊果酸的峰面積RSD為1.14%。實驗表明，樣品溶液在24 h內基本穩定。

2.9 加樣回收率實驗 稱取5份已知含量的藥材各0.5 g，精密稱定。分別精密加入含齊墩果酸、熊果酸的混合對照品溶液1 mL(含齊墩果酸1.3 mg，熊果酸2.3 mg)。5份樣品按2.3項樣品溶液的制備方法處理，依上述色譜條件測定，計算回收率，結果見表1。

2.10 樣品含量測定 精密稱取葉、莖各1 g，分別置于250 mL圓底燒瓶，各加入25 mL甲醇，回流提取2 h，過濾，回收甲醇，10 mL水溶解，石油醚萃取兩次，每次20 mL，水層回收至干，再用25 mL甲醇溶解，過濾，定容至25 mL量瓶中，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液 。按以上色譜條件進行測定，測得葉中齊墩果酸平均含量0.109 8 mg/g(n=5，RSD=1.92%)，熊果酸平均含量0.143 92 mg/g(n=5，RSD=3.04%);莖中齊墩果酸平均含量0.026 3 mg/g(n=5，RSD=1.58%)，熊果酸平均含量0.028 1mg/g(n=5，RSD=2.66%)。

表1 回收率實驗結果(n=5)

3 討論

3.1 樣品液制備方法的優化 齊墩果酸、熊果酸的提取溶劑主要有氯仿、乙醇、乙醚，提取方法有超聲法、索式提取法、回流提取法［7-8］。本實驗用甲醇作為溶劑，采用超聲法、回流方法提取，結果表明回流法效果好，進一步考察去除葉綠素的方法，分別考察石油醚萃取或石油醚先脫脂后提取，結果表明石油醚萃取效果好，同時，采用正交設計，對提取溶劑體積、提取次數、提取時間、石油醚萃取次數、石油醚用量進行考察，確定最佳工藝。

3.2 齊墩果酸、熊果酸互為同分異構體，極性相近，兩者不容易分開。本實驗通過甲醇-0.1%磷酸以不同比例(75∶25、78∶22、80 ∶20)混合作為流動相，考察其分離度，結果210 nm為檢測波長，流速1.0 mL/min，甲醇:0.1%磷酸(80∶20)，樣品中齊墩果酸、熊果酸分離較好，故本試驗最終確定此色譜條件。

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