NF-κB信號途徑在小鼠狼瘡性腎炎發(fā)病中的可能作用①

封曉娟 劉淑霞 張玉軍 郭惠芳 郝 軍 陳 寧 唐麗娟 劉青娟 吳海江

（河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室,石家莊 050017）

NF-κB信號途徑在小鼠狼瘡性腎炎發(fā)病中的可能作用①

封曉娟 劉淑霞 張玉軍 郭惠芳 郝 軍 陳 寧 唐麗娟 劉青娟 吳海江

（河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室,石家莊 050017）

目的:探討NF-κB信號途徑在小鼠狼瘡性腎炎發(fā)病中的可能作用。方法:選取16周齡的雄性BXSB小鼠（狼瘡性腎炎模型組）和同周齡C57BL/6小鼠（正常對照組）作為研究對象,透射電鏡和PAS染色觀察腎組織的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)改變;RT-PCR技術(shù)檢測小鼠全血中HMGB1mRNA的表達(dá)變化。采用ELISA方法檢測血清中HMGB1蛋白濃度;免疫組織化學(xué)檢測腎組織中HMGB1和PCNA蛋白的表達(dá)變化;Western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測腎組織中RAGE、p-NF-κB和IκB蛋白的表達(dá)。結(jié)果:16周時(shí),與正常的C57BL/6小鼠相比,BXSB小鼠血清中BUN水平及尿中微球白蛋白水平明顯升高;與正常的C57BL/6小鼠相比,BXSB小鼠全血中HMGB1mRNA水平和血清中HMGB1蛋白濃度明顯升高;16周時(shí),與正常的C57BL/6小鼠相比,BXSB基底膜明顯增厚,部分足突融合,內(nèi)皮細(xì)胞下可見團(tuán)塊狀電子致密物沉積;與正常的C57BL/6小鼠相比,BXSB小鼠腎組織的腎小球中可見較多的PCNA陽性表達(dá),腎小管上皮細(xì)胞核內(nèi)也可見少量的表達(dá);BXSB小鼠腎組織中HMGB1蛋白表達(dá)升高,HMGB1蛋白尤其在細(xì)胞增生明顯而肥大的腎小球呈高表達(dá),主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞外;而在C57BL/6小鼠腎臟組織中以小管細(xì)胞核表達(dá)為主;與對照組相比,BXSB小鼠腎組織p-NF-κB和RAGE蛋白表達(dá)明顯升高;而IκB蛋白表達(dá)明顯降低;HMGB1蛋白與p-NF-κB蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.833,P=0.000）;p-NF-κB蛋白與 RAGE蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.621,P=0.018）;HMGB1蛋白與 RAGE蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.848,P=0.000）;p-NF-κB蛋白與 IκB蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.759,P=0.002）。結(jié)論:HMGB1在小鼠狼瘡性腎炎中的致炎作用可能部分通過結(jié)合其受體RAGE,激活NF-κB信號途徑,促進(jìn)腎小球固有細(xì)胞的增生,從而導(dǎo)致增生性腎小球腎炎形成而實(shí)現(xiàn)的。

狼瘡性腎炎;HMGB1;RAGE;NF-κB;IκB;細(xì)胞增殖

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus,SLE）是一種侵犯多系統(tǒng)的自身免疫性疾病,常伴腎臟受累即狼瘡性腎炎（Lupusnephritis,LN）。其病理變化主要為系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)增多,并伴有明顯的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤。目前研究證實(shí),細(xì)胞因子在SLE的發(fā)病和病變進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要的作用。高遷移率族蛋白1（High mobility group protein box 1,HMGB1）是最新發(fā)現(xiàn)的一種新型炎性細(xì)胞因子,參與細(xì)胞核內(nèi)多種生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn),HMGB1是狼瘡性腎炎發(fā)病過程的重要的細(xì)胞因子之一,且與患者蛋白尿的形成有關(guān),TLR4（Toll like receptor 4,TLR4）是其受體之一,但并非是主要的受體[1],同時(shí)其作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。因此為了探討其在狼瘡性腎炎發(fā)病過程中的信號機(jī)制,本研究以 BXSB小鼠為研究對象,觀察HMGB1在其腎組織中的表達(dá)變化,并通過檢測PCNA、p-NF-κB、IκB 和晚期糖基化終產(chǎn)物受體（Receptor for advanced glycation end products,RAGE）的表達(dá)變化,分析其與HMGB1的相關(guān)性,闡明NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制在狼瘡性腎炎發(fā)病中的可能作用,為臨床對狼瘡性腎炎的防治提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 兔抗小鼠Phospho-NF-κB p65（Ser276）多克隆抗體（Cell signaling）;兔抗鼠HMGB1多克隆抗體（abcom）;兔抗鼠RAGE（Bioreagent）、PCNA 單克隆抗體（Santa Cruz）;IκB（eBioscience）,β-actin（北京中杉金橋公司）,HRP標(biāo)記的IgG二抗（北京中杉金橋公司）,免疫組織化學(xué)試劑盒（晶美生物工程有限公司）,NF-κB原位雜交試劑盒（Santa Cruz）;Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter）;化學(xué)發(fā)光法西門子全自動(dòng)免疫化學(xué)發(fā)光分析儀;RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）;HMGB1 ELISA試劑盒（Unionhoest公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 11周齡雄性BXSB小鼠16只,體重18～22克,引種自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室,由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系繁殖飼養(yǎng);另取11周齡雄性C57BL/6小鼠14只,體重18～22克,購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心。所有動(dòng)物于清潔環(huán)境中飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料,動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水。周齡雄性BXSB小鼠為狼瘡性腎炎模型組（LN組）,同周齡雄性C57BL/6小鼠為正常對照組,所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)起點(diǎn)為12周齡初、實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)為16周齡末,共四周。

1.3 標(biāo)本采集 所有小鼠均于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)眼眶取血,處死動(dòng)物。腎臟皮質(zhì)分別于4%多聚甲醛、2.5%戊二醛固定,另留取于液氮速凍后轉(zhuǎn)至-153℃冰箱待用。

1.4 血清BUN、Ccr水平及尿微量白蛋白的測定膀胱穿刺取尿,化學(xué)發(fā)光法西門子全自動(dòng)免疫化學(xué)發(fā)光分析儀檢測尿微量球蛋白;內(nèi)眥靜脈取血,室溫靜止2小時(shí),離心后取上清,用希森美康CHEMIX-180全自動(dòng)生化測定儀測定BUN和Ccr水平。

1.5 ELISA方法檢測血清中HMGB1的濃度 檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。采用常規(guī)雙抗體夾心ELISA法檢測,TMB顯色,在450 nm處測定吸光度（A）值。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中HMGB1的濃度。

1.6 RT-PCR技術(shù)檢測小鼠全血中HMGB1mRNA的表達(dá)變化 內(nèi)眥靜脈取血,采用RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒提取新鮮血液樣品總RNA,在25 μl總體積中以O(shè) ligo（dT）15引物將2μg總反轉(zhuǎn)錄成cDNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增合成內(nèi)參18SrRNA和目的DNA。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5分鐘,94℃變性1分鐘,不同退火溫度退火時(shí)間60秒,72℃延伸60秒,循環(huán)35次,72℃再延伸8分鐘（PCR引物序列及PCR反應(yīng)條件詳見表1）。取5μl PCR產(chǎn)物,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠上電泳。用凝膠成像系統(tǒng)攝像后并讀取其積分吸光度值。根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳條帶與內(nèi)參照18S rRNA相對強(qiáng)度的比值來確定mRNA的相對表達(dá)水平。

1.7 常規(guī)光鏡檢查 腎組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后,常規(guī)脫水、包埋,切片厚2μm,分別行HE和PAS染色。

1.8 電鏡觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化 腎皮質(zhì)組織2.5%的戊二醛4℃固定4小時(shí),繼以2%鋨酸固定2小時(shí),然后用梯度丙酮脫水,Epon812浸透與包埋,超薄切片機(jī)進(jìn)行切片,醋酸鈾及檸檬酸鉛電子染色,H-7500透射電鏡觀察、照相。

1.9 免疫組織化學(xué)檢測腎組織中HMGB1及PCNA的表達(dá)變化 切片厚4μm,常規(guī)脫蠟水化,一抗為兔抗鼠PCNA單克隆抗體（1∶50稀釋）、兔抗鼠HMGB1多克隆抗體（1∶200）,二抗為生物素化羊抗兔IgG（1∶100稀釋）,以PBS代替一抗作為陰性對照,DAB顯色,光鏡觀察陽性信號。結(jié)果判定:HMGB1陽性信號定位于細(xì)胞核、細(xì)胞漿或細(xì)胞外,為棕黃色顆粒;PCNA陽性信號均定位于細(xì)胞核呈棕黃色顆粒。

表1 PCR引物序列及PCR反應(yīng)條件Tab.1 PCR p rimer

1.10 FCM 檢測腎組織中HMGB1、RAGE、p-NF-κB和IκB蛋白的表達(dá)變化 將標(biāo)本用網(wǎng)搓法制成單細(xì)胞懸液,采用間接免疫熒光標(biāo)記方法,取單細(xì)胞懸液1×106ml-1,加入兔抗鼠HMGB1、RAGE、p-NF-κB 和IκB多克隆抗體0.1ml,室溫孵育30分鐘,PBS洗滌后加入1∶50羊抗兔FITC-IgG二抗工作液100μl,避光室溫孵育30分鐘,PBS洗滌后,在Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。數(shù)據(jù)和組方圖輸入計(jì)算機(jī),應(yīng)用Expo32 ADC軟件進(jìn)行免疫熒光資料分析。設(shè)PBS代替一抗和二抗的陰性對照,以及只加一抗或二抗的陽性對照和同型對照。以熒光指數(shù)（FI）表示HMGB1、p-NF-κB、RAGE 和 IκB 的相對含量,公式 :

FI=（樣品蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度 -對照樣品平均熒光強(qiáng)度）/正常對照樣品平均熒光強(qiáng)度。

1.11 Western blot檢測腎組織中RAGE的表達(dá)變化取100mg腎組織,碾碎后加入1m l細(xì)胞裂解液超聲粉碎,4℃15 000 r/m in離心15分鐘,上清用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。相同量的蛋白經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉37℃封閉2小時(shí)后,加入兔抗小鼠 RAGE抗體（1∶200）、actin多克隆抗體（1∶1 000）,4℃過夜。TBST漂洗后滴加HRP標(biāo)記的IgG二抗（1∶5 000）雜交,洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光并曝光成像,利用圖像分析系統(tǒng)掃描。β-actin作為內(nèi)參照,結(jié)果用靶蛋白/β-actin的相對吸光度值表示。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠腎功能比較 16周時(shí),BXSB小鼠血清中BUN水平為（9.60±0.83）,尿微球蛋白水平為

（3.94±0.39）,明顯高于正常對照組（6.95±0.96;2.50±0.05）（P＜0.01,P＜0.01）;而CCr水平相比兩者無顯著性差異P＞0.05,表2。

2.2 不同組血清中HMGB1蛋白水平的表達(dá)變化

ELISA檢測結(jié)果顯示,狼瘡性腎炎模型組小鼠血清HMGB1蛋白（0.570 4±0.025 6）明顯高于正常對照組（0.536 5±0.001 5）（表2,P=0）。

2.3 不同組小鼠全血中HMGB1mRNA的表達(dá) RTPCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,正常小鼠全血中幾乎檢測不到HMGB1mRNA的表達(dá),而BXBS小鼠血中HMGB1mRNA相對表達(dá)量為（0.367 4±0.130 5）,明顯高于正常對照組（圖1,P＜0.05）。

2.4 兩組小鼠腎組織形態(tài)學(xué)改變 16周時(shí),與正常對照組相比,狼瘡性腎炎模型組小鼠腎小球基底膜明顯不規(guī)則增厚,部分足突融合,內(nèi)皮細(xì)胞下可見團(tuán)塊狀電子致密物沉積（圖2和圖3）。

2.5 HMGB1蛋白在不同組小鼠腎組織的表達(dá)變化

圖1 HMGB1 mRNA在正常對照和狼瘡性腎炎模型組全血中的表達(dá)變化Fig.1 Expression of HMGB1mRNA in blood of control and LN group by RT-PCR

表2 不同組腎功能比較Tab.2 Rena l function change of different groups

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,HMGB1蛋白陽性信號定位于細(xì)胞核、細(xì)胞漿或細(xì)胞外。在正常對照組小鼠腎組織中可見HMGB1少量表達(dá),主要定位于腎小管上皮細(xì)胞胞核,腎小球表達(dá)甚少,而在狼瘡性腎炎模型組小鼠腎組織中HMGB1表達(dá)升高,腎小球和腎小管內(nèi)均有表達(dá),且主要定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞外,尤其在細(xì)胞增生明顯的腎小球中呈強(qiáng)陽性表達(dá)（圖4）。

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,與正常對照組小鼠相比,狼瘡性腎炎模型組小鼠腎皮質(zhì)中HMGB1蛋白表達(dá)升高,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異（P＜0.01,表3）。

2.6 不同組腎組織中PCNA的表達(dá)變化 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,PCNA陽性信號主要定位于細(xì)胞核;正常對照組小鼠腎組織中未見PCNA陽性表達(dá),而狼瘡性腎炎模型組小鼠腎組織的腎小球中可見較多的陽性表達(dá),腎小管上皮細(xì)胞核內(nèi)也可見少量的表達(dá)（圖5）。

圖2 PAS染色觀察不同組別腎組織的形態(tài)學(xué)變化（×400）Fig.2 PASstains of renal tissue in LN group（16 weeks）andcontrol group（×400）

圖3 透射電鏡觀察不同組腎小球基底膜的變化（20 000×）Fig.3 Transm ission electron m icroscope for change of basementmembrane in control and LN group（20 000×）

2.7 p-NF-κB 、IκB 和 RAGE 在不同組腎組織中的表達(dá)變化 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,與正常對照組相比,狼瘡性腎炎模型組小鼠腎皮質(zhì)中RAGE和 p-NFκB蛋白表達(dá)均升高,而IκB蛋白表達(dá)降低,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異（P＜0.05或0.01,表3）。Western b lot結(jié)果顯示,狼瘡性腎炎模型組小鼠腎組織中RAGE相對吸光度值為22.49±12.71,明顯高于正常對照組（2.69±0.64）見圖6,P＜0.01。

圖4 免疫組織化學(xué)檢測正常對照和狼瘡性腎炎模型組腎組織中HMGB1蛋白的表達(dá)變化（IHC,400×）Fig.4 Expression of HMGB1 in renal tissue of control and LN group（IHC,400×）

圖5 PCNA在正常對照和狼瘡性腎炎模型組腎組織中的表達(dá)變化（IHC,400×）Fig.5 Expression of PCNA in renal tissue of control and LN group（IHC,400×）

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測正常對照組和狼瘡性腎炎模型組腎組織中HMGB1、RAGE、NF-κB和IκB蛋白的表達(dá)變化（±s）Tab.3 Expression of HMGB1,RAGE,NF-κB and IκB in renal tissue of controland LN group by FCM（±s）

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測正常對照組和狼瘡性腎炎模型組腎組織中HMGB1、RAGE、NF-κB和IκB蛋白的表達(dá)變化（±s）Tab.3 Expression of HMGB1,RAGE,NF-κB and IκB in renal tissue of controland LN group by FCM（±s）

Note:t-test,1）P＜0.05,2）P＜0.01 vs control.

Groups n HMGB1 p-NF-κB RAGE IκB Control group 7 1.00±0.04 1.00±0.13 1.00±0.06 1.00±0.05 LN group 7 1.28±0.072） 1.21±0.151） 1.25±0.042） 0.78±0.042）

圖6 RAGE在正常對照和狼瘡性腎炎模型組腎組織中的表達(dá)變化Fig.6 Expression of RAGE in renal tissue of control and LN group by Western blot

2.8 相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson's相關(guān)分析,HMGB1蛋白與p-NF-κB蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.833,P=0.000）;p-NF-κB蛋白與RAGE蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.621,P=0.018）;;HMGB1蛋白與RAGE蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.848,P=0.000）p-NF-κB蛋白與 IκB 蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.759,P=0.002）。

3 討論

雄性BXSB小鼠由于攜帶Y染色體連鎖的自身免疫增強(qiáng)基因（Yaa基因）而于第八周齡開始發(fā)生自發(fā)性自身免疫性疾病,類似于人類SLE,是狼瘡性腎炎研究比較常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,其中后期腎臟改變類似人類Ⅳ型狼瘡性腎炎。本研究發(fā)現(xiàn),16周時(shí),BXSB小鼠出現(xiàn)了明顯的狼瘡性腎炎的病理表現(xiàn)即腎小球基底膜增厚、足突融合、內(nèi)皮下電子致密物沉積,同時(shí)腎小球內(nèi)細(xì)胞明顯增生,同時(shí)伴有腎功能的下降。上述改變與臨床狼瘡性腎炎的病理變化很相似。

作為一個(gè)新型細(xì)胞因子,HMGB1在急慢性炎癥性疾病中的作用得到越來越多的重視。已往的研究己經(jīng)證實(shí),HMGB1參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[2,3]。我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HMGB1是狼瘡性腎炎發(fā)病中的一個(gè)重要細(xì)胞因子,且與蛋白尿的形成有關(guān)[1]。本研究顯示,BXSB小鼠外周血中HMGBmRNA及血清中HMGB1蛋白水平均明顯高于正常對照組,提示狼瘡性腎炎發(fā)病過程中外周血單個(gè)核細(xì)胞能夠合成和分泌HMGB1,導(dǎo)致血清中HMGB1水平升高,從而引起腎臟損害。

我們采用免疫組織化學(xué)的方法檢測了HMGB1蛋白在腎組織中的定位和表達(dá)強(qiáng)度,結(jié)果顯示,C57BL/6小鼠腎組織中,HMGB1只表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞核內(nèi),不表達(dá)于胞漿和細(xì)胞外,說明在正常腎組織中,HMGB1是一種典型的DNA結(jié)合蛋白,承擔(dān)著“DNA伴侶”作用,在DNA修復(fù)、重組、細(xì)胞分化中起著重要作用[4];而在BXSB小鼠腎組織中HMGB1蛋白表達(dá)升高,主要定位腎小球和腎小管的細(xì)胞漿或細(xì)胞外,且在細(xì)胞增生明顯的腎小球中呈強(qiáng)陽性表達(dá),表明在狼瘡性腎炎發(fā)病過程中伴有腎組織中HMGB1的表達(dá)升高,而且HMGB1表達(dá)的移位與其發(fā)揮細(xì)胞因子功能進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)密不可分。但是腎小球中高表達(dá)的HMGB1是外周血單個(gè)核細(xì)胞合成釋放的還是浸潤在腎組織中的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞合成釋放的抑或是腎小球系膜細(xì)胞合成轉(zhuǎn)位形成的,目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚不能確定,需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

HMGB1最重要的受體之一是晚期糖基化終產(chǎn)物受體（Receptor for advanced glycation end products,RAGE）。RAGE是個(gè)多配體受體,屬于免疫球蛋白超家族,是一個(gè)能擴(kuò)大和加劇免疫反應(yīng)的跨膜蛋白[5]。HMGB1與RAGE之間的結(jié)合力強(qiáng),在部分未成熟的或者惡性程度高的腫瘤中,HMGB1和RAGE兩者共表達(dá),且和腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[6-8]。RAGE在腎臟疾病中也具有重要作用,Yamamoto等將人RAGE基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入動(dòng)物,使動(dòng)物強(qiáng)制性表達(dá)RAGE,與對照組相比,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物出現(xiàn)了腎臟增大、腎小球肥大、蛋白尿增加等損害[9]。人類IV型狼瘡性腎炎的腎小球系臟層上皮細(xì)胞中也表達(dá)RAGE[10]。RAGE能在單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞表面表達(dá),通過與其配體結(jié)合,趨化單核巨噬細(xì)胞,導(dǎo)致血管內(nèi)皮的損傷,血管炎的形成,并誘導(dǎo)系膜細(xì)胞產(chǎn)生多種基質(zhì)成分使得腎小球發(fā)生纖維化[11]。本研究結(jié)果顯示,在狼瘡性腎炎腎組織中RAGE蛋白表達(dá)明顯高于正常對照組,且與HMGB1蛋白表達(dá)升高具有一致性。因此推斷,HMGB1在小鼠狼瘡性腎炎中的致炎作用可能是通過結(jié)合RAGE后激發(fā)下游反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。

細(xì)胞因子與受體蛋白結(jié)合后需要一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子將信號傳入細(xì)胞內(nèi)。HMGB1與RAGE結(jié)合后能激活NF-κB、MAPK、纖溶酶原激活物抑制劑、Cdc42和Rac等信號傳導(dǎo)途徑,傳遞炎癥信息,激發(fā)炎癥反應(yīng)[12]。本研究采用磷酸化NF-κB抗體檢測腎組織中NF-κB蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,狼瘡性腎炎模型組小鼠腎組織中p-NF-κB蛋白表達(dá)顯著高于正常對照組,而IκB低于正常對照組,提示在小鼠狼瘡性腎炎的發(fā)病過程中,下調(diào)IκB的表達(dá)使NF-κB的解離增加,促進(jìn)NF-κB的核轉(zhuǎn)位,增加促炎介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)與釋放,從而促進(jìn)炎癥的級聯(lián)反應(yīng);同時(shí)還發(fā)現(xiàn),RAGE和NF-κB蛋白表達(dá)高度正相關(guān),因此推斷,細(xì)胞因子HMGB1與其受體蛋白R(shí)AGE結(jié)合后,觸發(fā)一系列級聯(lián)過程,使得NF-κB激活和異位,從而引起腎小球細(xì)胞的增生。

綜上所述,細(xì)胞因子HMGB1參與了狼瘡性腎炎的發(fā)病過程,其機(jī)制可能是通過與其受體RAGE結(jié)合,激活I(lǐng)κB/NF-κB信號途徑,從而介導(dǎo)腎小球細(xì)胞的增生及狼瘡性腎炎的發(fā)生。

1 劉淑霞,郝 軍,郭惠芳etal.TLR4介導(dǎo)高遷移率族蛋白致系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎損害的作用機(jī)制研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2008;28（12）:1079-1083.

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[收稿2009-09-02]

（編輯 許四平）

Effect of NF-κB signal pathway in murine lupus nephritis

FENGXiao-Juan,LIUShu-Xia,ZHANGYu-Jun,GUOHui-Fang,HAOJun,CHENNing,TANGLi-Juan,LIUQing-Juan,WUHai-Jiang.DepartmentofPathology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China

Objective:To investigate the expression andmechanism of NF-κB signal pathway inmurine lupus nephritis.Methods:The BXSBmice aswell as C57BL/6 of 16weekswereused.Transmission electronmicroscope and PASwereused to detect the pathological change of renal tissue.RT-PCR and ELISAwere used to detect the expression of HMGB1mRNA and p rotein.The expression of HMGB1,p-NF-κB,RAGE,IκB and PCNA p roteinwas detected by immunohistochemical stain,FCM and Westernb lot.Results:The level of BUN in serum and Micro-albumin in urine of BXSBmicewas higher than that in C57BL/6mice.The expression ofHMGB1mRNA and HMGB1 protein level in peripheral blood increased significantly in BXSBgroup.Compared with those in controlgroup,electronmicroscopy and PAS revealed the thickness of glomerularbasementmembrane（GBM）,fusion of footprocesses partly of epithelial delland subepithelial electron-dense deposits in the renal tissue of BXSBAmice.Compared with thatof controlgroup,expression of PCNAwas higher in glomeruli of BXSBmouse.HMGB1 proteinoverexpression localized in cytoplasm and extracellularmilieu,especially in proliferativeglomeruliin BXSB group,while the HMGB1 protein primarily confined to the nuclear of tubule in control group.In BXSB group,the expression of p-NF-κB and RAGE increased,while the expression of IκB decreased.Therewere positive correlationbetween the expressionof HMGB1,RAGE and p-NF-κB protein（r=0.833,0.621,0.848,P＜0.01）,while the expression of p-NF-κB protein negatively correlated with thatof IκB.Conclusion:HMGB1 could activate NF-κB through combiningwith its receptor-RAGE,induce the form of proliferative glomerulonephritis by promoting the proliferation of inherent cell of glomeruli,whichmay play an important role in themurine lupusnephritis.

Lupus nephritise;HMGB1;RAGE;NF-κB;IκB;Cell proliferation

R363 R593

A

1000-484X（2010）02-0169-05

①本文為河北省自然科學(xué)基金（C2007000828）及河北省衛(wèi)生廳課題（08055）

封曉娟（1985年-）,女,在讀碩士,主要從事腎臟病理學(xué)研究,E-mail:fengxiaojuan1985@163.com;

及指導(dǎo)教師:劉淑霞（1976年-）,女,醫(yī)學(xué)博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事腎臟病理學(xué)研究,E-mail:susanliu1976@163.com。