肺結核患者外周血中Th細胞極化偏移及臨床意義分析①

胥 萍 施美華 費曉峰 朱傳武 吳妹英 吳敏娟 陳永井 張學光

（蘇州市第五人民醫院中心實驗室,蘇州 215007）

肺結核患者外周血中Th細胞極化偏移及臨床意義分析①

胥 萍 施美華 費曉峰 朱傳武 吳妹英 吳敏娟 陳永井②張學光②

（蘇州市第五人民醫院中心實驗室,蘇州 215007）

目的:分析初診肺結核患者外周血中CD4+T淋巴細胞及其亞型Th1和Th2細胞的改變,探討其在肺結核病變過程中的臨床意義。方法:取肝素抗凝全血,加RPMI1640培養液等體積混勻,依次加入1∶1 000稀釋的PMA、1∶100稀釋的Ionomycin和1∶10稀釋的Monensin,混勻后于37℃,5%CO2靜置培養4小時或過夜。取100μl培養血細胞依次加入抗人CD3-Per-CP、CD8-APC、m IgG1-FITC、Rat IgG1-PE、IL-4-PE、IFN-γ-FITC抗體,按流式操作流程分別進行細胞膜和細胞漿內標記測定CD4+IL-4+（Th2）、CD4+IFN-γ+（Th1）兩種細胞的水平。結果:初診肺結核患者外周血中Th1水平均顯著低于健康對照組（P＜0.01）,而Th2水平則顯著高于健康對照組（P＜0.05）。粟粒型肺結核患者外周血中Th1細胞含量顯著低于浸潤性肺結核患者（P＜0.05）,而Th2水平顯著高于浸潤性肺結核和結核性胸膜炎（P＜0.05）。CD4+/CD3+T細胞比例在這三個病程中呈下降趨勢,且粟粒型肺結核顯著低于浸潤性肺結核（P＜0.05）。糖尿病并肺結核患者Th1、CD4+/CD3+顯著低于無糖尿病肺結核患者（P＜0.05）,Th2含量則顯著升高（P＜0.05）。15例重度肺結核患者經結核化療與微卡治療三個月后Th1、CD4+/CD3+水平較治療前明顯升高（P＜0.05）,而Th2水平較治療前顯著降低（P＜0.01）。痰檢或培養陽性與痰檢陰性患者相比Th1、CD4+/CD3+水平呈下降趨勢但無顯著差異（P＞0.05）,Th2細胞水平顯著升高（P＜0.05）。結論:浸潤性肺結核、結核性胸膜炎、粟粒型肺結核、糖尿病并肺結核患者存在著不同程度的免疫功能抑制,對Th1、Th2細胞水平與CD4+/CD3+比例測定有助于臨床病情的判斷和療效觀察。

肺結核;細胞免疫;Th細胞;細胞極化

據傳染病疫情報告,目前肺結核已居傳染病發病數及死亡率第一,其疫情的快速上升已令世界衛生組織高度重視。以往多注重診斷、治療、耐藥等方面的研究,對其免疫功能的變化易忽視,而多數結核病患者都伴有免疫功能的異常,其結核病免疫是CD4+T淋巴細胞介導的細胞免疫應答,對結核病的發生、發展具有重要意義。CD4+T淋巴細胞因分泌不同因子而分為Th1和Th2型,其平衡與疾病的轉歸與愈合密切相關。為揭示肺結核患者體內Th細胞的極化特性,本研究應用流式細胞儀對患者外周血Th1/Th2進行檢測分析,進而探討其在肺結核免疫發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究病例 肺結核組73例,（其中浸潤型肺結核41例、結核性胸膜炎13例、粟粒型肺結核9例、肺結核合并糖尿病10例）。性別為男45例,女28例。年齡14～66歲,平均年齡為37.5歲。年齡、性別與對照組統計學處理無差異。臨床診斷以《肺結核診斷和治療指南》為標準[1]。

結核病確診依據[1]:①痰、胸水結核分支桿菌呈陽性,或活組織檢查呈結核特征性病變;②X線胸片肺及其它部出現結核特征性病灶;③臨床結核中毒癥狀明顯、其它檢查符合結核性特征;④抗結核治療后病灶、胸水吸收快。具備上述標準三項以上者方可確診。

判斷結核活動進展期、吸收好轉期、穩定期的標準:①活動進展期:凡具備下列一項者屬活動進展期:新發現活動性結核病灶;新出現空洞;空洞增大;病灶較前惡化;痰結核分支桿菌陽性。②吸收好轉期:凡具備下列一項者屬好轉期:結核病灶較前吸收好轉;空洞閉合變小;痰結核分支桿菌陰轉。③穩定期:病變無活動性;空洞閉合;痰結核分支桿菌連續陰性（每個月至少檢查1次,達六個月以上,如有空洞存在,則痰結核分支桿菌須連續陰性一年以上。

1.1.2 健康對照組 30例健康對照者均選自獻血員及健康體檢者。胸部X透視正常,近期無接觸結核病史者。男 20例,女 10例。年齡 20～60歲,平均35.7歲。PPD皮試5單位（IU）結果為陰性。

1.2 試劑與設備

1.2.1 主要試劑 鼠抗人CD3-PerCP、CD8-APC、IFN-γ-FITC、IL-4-PE、mIgG1-FITC,Rat IgG1-PE,FACS細胞破膜劑和FACS細胞溶血素（兩者使用前均用去離子水1∶10稀釋）均購自BD公司。

1.2.2 其他試劑 激活劑:佛波酯（phorbolmyristate acetate,PMA）于DMSO中調至濃度為0.1mg/ml,工作濃度為25 ng/ml。協同刺激劑:離子霉素（ionomycin）于乙醇中配成濃度0.5mg/m l,工作濃度為1 μg/ml。蛋白轉運抑制劑:莫能霉素（monensin）溶于乙醇中調節濃度為0.1mg/m l,工作濃度為1μg/m l。不含谷氨酰胺的RPMI1640、二甲基亞砜（DMSO）等均為美國Sigma公司產品。

1.2.3 儀器 FACSCalibur型流式細胞儀購自美國BD公司;TC2323水套式CO2培養箱為美國SL公司產品。

1.3 方法

1.3.1 標本的采集 空腹采集靜脈血2m l于肝素鈉抗凝管中,混勻備用。

1.3.2 細胞培養 取肝素抗凝全血200μl,加RPMI1640培養液200 μl混勻,取 200 μl加1∶1000稀釋的 PMA 10μl,1∶100稀釋的 Ionomycin 10 μl,1∶10稀釋的Monensin 3.4μl,混勻后加入5%CO2培養體系37℃靜置4小時或過夜。

1.3.3 淋巴細胞表面抗原及胞漿內細胞因子染色對照管和測定管分別加入培養全血100μl,依次加入抗人CD3-PerCP,CD8-APC熒光單克隆抗體10 μl,混勻后室溫避光反應15分鐘。加入FACS 1∶10稀釋溶血劑2 ml,混勻,室溫避光15～20分鐘。1 300 r/min離心5分鐘后棄上清液。加入含疊氮鈉無菌PBS 2ml,洗滌后加 1∶10稀釋的FACS破膜劑各 500μl,室溫避光10分鐘,加PBS 2m l,混勻,1 300 r/min離心5分鐘,棄上清。對照組加入m IgG1-FITC或Rat IgG1-PE各10μl,檢測組加入抗人IL-4-PE或IFN-γ-FITC各10μl,室溫避光反應 30分鐘,加入 2 ml PBS洗滌后棄上清。用500μl PBS重懸細胞,利用流式細胞儀檢測分析。以CD3+-SSC選定CD3+T細胞,為R1門,以 R1設門,CD3-PerCP、CD8-APC 作圖選定CD4+T細胞,為 R2門,對照管m IgG1-FITC、Rat IgG1-PE作圖劃定陰性區域,再換測定管,檢測IFN-γ、IL-4陽性細胞的含量（見圖1）。

1.4 統計學處理 數據由SPSS12.0軟件包處理,兩樣本均數（±s）用t檢驗。P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 肺結核患者外周血中免疫細胞比例異常 流式細胞儀檢測結果顯示,73例肺結核患者外周血中Th1、CD4+/CD3+細胞所占百分比較健康對照組顯著降低（前者P＜0.01,后者P＜0.05）,而Th2細胞水平較健康對照組顯著升高（P＜0.05,表1）。

2.2 肺結核患者外周血中Th1極化與疾病的惡性程度呈負相關 流式細胞儀檢測結果顯示,浸潤性肺結核、結核性胸膜炎、粟粒型肺結核三組間外周血中Th1細胞比例逐步下降,而Th2則有所上升（表2）。三組間粟粒型肺結核與浸潤性肺結核Th1、CD4+/CD3+水平有顯著降低（P＜0.05）,與結核性胸膜炎、浸潤性肺結核Th2水平比較有顯著升高（P＜0.05）。由此可見,隨著患者CD4+/CD3+細胞降低,Th1/Th2細胞比值逐漸增高。

2.3 糖尿病并肺結核患者外周血中Th1/Th2細胞含量異常失衡 糖尿病并肺結核患者外周血中CD4+/CD3+的比值相對無糖尿病肺結核患者略小,免疫功能低下,兩組間Th1/Th2比值有顯著差異（表3）。

圖1 人外周血各淋巴細胞亞群的選擇及分析Fig.1 The selection and analysis of human peripheral lym phocyte

表1 73例肺結核患者與健康對照組外周血 Th1/Th 2、CD4+/CD3+水平比較Tab.1 Comparison of Th1/Th2 and CD4+/CD3+in the peripheralblood of73 pulmonary tuberculosis patients or healthy donors

表2 浸潤性肺結核、結核性胸膜炎、粟粒型肺結核 Th1/Th2、CD4+/CD3+比較Tab.2 Comparison of Th1/Th2 and CD4+/CD3+in the peripheral blood of infiltrative pulmonary tuberculosis,tuberculous p leurisy andm iliary pu lmonary tuberculosis patients

表3 DM并肺結核與無糖尿病肺結核患者外周血Th1、Th2、CD4+/CD3+水平Tab.3 Comparison of Th1/Th2 and CD4+/CD3+between the patients with pulmonary tuberculosis disease and the patientswith both pulmonary tuberculosis and diabetes disease

表4 15例重度患者經藥物與微卡治療三個月前后Th1/Th2、CD4+/CD3+的水平Tab.4 The levels of Th1,Th2 and CD4+/CD3+in 15 severe pulmonary tuberculosis patients after receiving tuberculosis chemotherapy and m icrocalorie theropy for threemonths

表5 肺結核痰檢或培養陽性、陰性患者的Th1、Th2、CD4+/CD3+水平Tab.5 The levels of Th1,Th2 and CD4+/CD3+in the patients with positive or negative sputum exam ination results

2.4 肺結核患者治療療效與Th細胞平衡相關 流式細胞儀檢測分析結果經統計學分析表明,15例重度肺結核患者經結核化療與微卡治療三個月前后Th1/Th2、CD4+/CD3+的水平有顯著改善（表 4）。臨床觀察發現療效顯著（癥狀明顯改善或消失,肺部病灶吸收良好）的患者外周血中Th1、CD4+/CD3+水平較治療前明顯升高（P＜0.05）,而Th2水平較治療前顯著降低（P＜0.01）。

2.5 Th細胞極化與結核桿菌密切相關 流式細胞儀檢測結果顯示,痰檢或培養陽性與痰檢陰性Th1、CD4+/CD3+比較有下降趨勢但無顯著差異（P＞0.05）,痰檢或培養陽性與痰檢陰性相比Th2細胞水平則有顯著升高（P＜0.05,表5）。

3 討論

1986年,Mosmann等[2]在小鼠模型上首次發現CD4+T細胞的兩個亞群Th1與Th2,1991年Romagnan[3]在人類病變組織浸潤的淋巴細胞上也發現了同樣的細胞特性。隨后,許多學者對Th1與Th2在肺結核病理、生理過程中的作用機制展開了一系列的研究,結果表明,CD4+T細胞對結核分枝桿菌感染的保護性免疫作用主要是分泌多種細胞因子而放大免疫效應。Th1細胞主要分泌IL-2和IFN-γ,誘發細胞免疫應答,其中IFN-γ能夠通過增強作為效應細胞的巨噬細胞表面人類組織相關抗原Ⅱ（MHCⅡ）分子的表達,促進巨噬細胞對抗原的遞呈和自身的活化,啟動機體的免疫應答。IFN-γ也可通過誘導巨噬細胞內某些介導呼吸爆發的酶的合成,使殺菌物質合成增加[4],賦予巨噬細胞更強的殺菌能力。同時,IFN-γ進一步促使Th0分化為Th1細胞亞群,增強Th1細胞免疫應答,有助于殺傷病原微生物。Th2細胞主要分泌IL-4和IL-10,有效激活B細胞產生抗體,參與誘導體液免疫應答。IL-4能抑制巨噬細胞的活化,拮抗IFN-γ活化巨噬細胞后的效應[5]。因此,Th2細胞合成的細胞因子能減緩由巨噬細胞介導的免疫應答。有學者認為在刺激狀態下IL-4表達增加與結核性空洞形成密切相關[6]。所以,當這種平衡失調時,將直接影響結核病的進展。Th1和Th2分泌的多種細胞因子相互調節、相互抑制,對結核病的治療和轉歸起著重要的作用。

本研究中我們選取健康志愿者及不同程度的結核病患者外周血,應用流式細胞術進行一系列的分析,結果表明肺結核患者Th1細胞數量較健康對照組低（P＜0.05）,且隨著病情加重呈現下降趨勢,患者體內存在Th1、Th2細胞亞群的轉化而使Th1、Th2的比例失衡,同時,CD4+/CD3+的比值與Th1呈正相關。我們認為,可能是病變部位CD4+T細胞和巨噬細胞的凋亡增強,而且該比值預示結核病惡化的傾向[7]。體外研究發現細胞凋亡增強是與結核分枝桿菌反應性T淋巴細胞數目的減少或缺失同時發生的,從而導致宿主淋巴細胞對結核分枝桿菌的反應低下。Hirsch等[8]認為結核分枝桿菌反應性T淋巴細胞凋亡的增加可能導致結核桿菌在宿主體內長期存在。有研究認為,結核病患者對結核分枝桿菌是以Th1細胞為主的細胞免疫抑制,Th1細胞的抑制能力與疾病嚴重程度密切相關[9]。同時,Th2細胞數量增加提示疾病可能向重癥發展。我們在痰檢陽性和陰性兩組病例比較中發現,陽性患者Th2細胞水平顯著升高（P＜0.05）,胸片顯示有空洞的占35.6%（16例）。由此推測,Th2細胞數量增加可能降低宿主的細胞免疫功能,使疾病向重癥、排菌和空洞形成的方向發展。糖尿病并發肺結核患者由于免疫功能低下,使得IFN-γ的分泌量較低,其細胞免疫功能嚴重受抑,而IL-4水平卻顯著增加,使病情遷延難愈。15例重度結核病患者經結核化療與微卡治療后Th1和Th2細胞數量均顯著改善。微卡治療對人和動物無毒無害,具有與結核分枝桿菌相似的抗原表位和免疫原性,含有豐富的I型抗原和65 kD抗原,可有效介導保護性免疫反應,促進Th1細胞分泌更多的IL-2和IFN-γ等細胞因子,進而激活巨噬細胞,使得巨噬細胞吞噬結核桿菌的能力增強[10]。本研究中肺結核患者臨床微卡治療采用每周一次22.5μg肌注,三個月一療程。研究結果提示,抗結核治療和免疫輔助治療相結合有助于提高患者機體的免疫功能,患者外周血中Th1細胞較治療前增加（P＜0.05）,而Th2細胞含量較治療前顯著降低（P＜0.01）,CD4+/CD3+比值亦顯著升高（P＜0.05）,該組結核病患者臨床癥狀明顯改善或消失,肺部病灶吸收良好。因此,輔助微卡治療可以誘導Th0向Th1極化,從而抑制Th2細胞的極化和細胞因子的分泌,使Th1和Th2維持一個動態平衡。

總之,動態分析Th1、Th2細胞比例與CD4+/CD3+比值有助于觀測該疾病的臨床診治和轉歸。

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2 Mosmann T R,Cherwinski H,Bond M Wetal.Two types ofmurine helper T cell clone.I.Definition according to profilesof lymphokine activitiesand secreted proteins[J].JImmunol,1986;136（7）:2348-2357.

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4 Flesch I E,Kaufmann SH.Mechanisms involved in mycobacterial growth inhibition by gamma interferon-activated bonemarrowmacrophages:role of reactive nitrogen intermediates[J].Infect Immun,1991;59（9）:3213-3218.

5 謝惠安,楊國太,林善梓etal.現代結核病學[M].人民衛生出版社,2000:136-235.

6 Van CrevelR,Karyadi E,Preyers Fetal.Increased production of interleukin 4by CD4+and CD8+T cells from patientswith tuberculosis is related to the presence of pulmonary cavities[J].J Infect Dis,2000;181（3）:1194-1197.

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8 Hirsch CS,ToossiZ,Johnson JLetal.Augmentation ofapoptosisand interferon-gamma production at sites of active Mycobacterium tuberculosis infection in human tuberculosis[J].JInfect Dis,2001;183（5）:779-788.

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10 羅永艾.微卡治療結核病的機制療效及安全性[J].中國防癆雜志,2002;24（10）:28-29.

[收稿2009-02-11 修回2009-12-03]

（編輯 倪 鵬）

Study on T helper cells in the patients of pulmonary tuberculosis and the clinical significance of Th polarization

XUPing,SHIMei-Hua,FEIXiao-Feng,ZHUChuan-Wu,WUMei-Ying,WUMin-Juan,CHENYong-Jing,ZHANG Xue-Guang.DepartmentofMedicalLaboratory,No.5HospitalofSuzhou,Suzhou215007,China

Objective:This studywas to analyze the changes of CD4+T lymphocytes and their subtypes,Th1 and Th2 cells,in the peripheral blood of patientswith pulmonary tuberculosisdisease and to investigate their clinical significance in the pathologic processof pulmonary tuberculosis.Methods:For polarizationmeasurement of T-helper cells,1∶100 diluted Ionomycin and 1∶10 dilutedMonensin were added in sequence into the equivalent volumem ixture of heparin anti-coagulated whole b lood and RPMI-1640 culture liquid.After being wellmixed,the mixture was incubated at5%CO2,37℃ for4 hours orovernight.To 100μlof themixture and in sequence,the antibodiesof CD3-PerCP,CD8-APC,m IgG1-FITC,Rat IgG1-PE,IL-4-PE or IFN-γ-FITCwere added.The stained CD4+IL-4+（Th2）and CD4+IFN-γ+（Th1）were analyzed by flow cytometry.Results:Comparedwith those from healthy controls,the peripheralblood of pulmonary tuberculosis patients contained significantly fewer Th1（P＜0.01）but significantlymore Th2 cells（P＜0.05）.Th1 cells in the peripheral blood of the patientswithmiliary pu lmonary tubercu losiswere obviously fewer（P＜0.05）than in infiltrative pulmonary tuberculosis patients.The amount of Th2 cells in the peripheral blood of the patientswithmiliary pulmonary tuberculosiswas significantlymore（P＜0.05）than in either infiltrative pulmonary tuberculosis or tubercu lous pleurisy patients.The ratio of CD4+/CD3+tended to decrease in all these patients,and itwasmuch lower（P＜0.05）in the patients ofm iliary pulmonary tuberculosis than in infiltrative pulmonary tuberculosis patients.Patients suffering from both pulmonary tuberculosis and diabetes had significantly lower levels of Th1 cells and CD4+/CD3+（P＜0.05）and more Th2 cells,compared with those of pu lmonary tubercu losis patientswithout diabetes.Levels of Th1 and Th2 cells restored significantly（P＜0.05）in 15 severe pulmonary tuberculosis patients after receiving tuberculosis chemotherapy andmicrocalorie theropy for threemonths.Patientswith positive sputum examination tended to have decreased Th1 and CD4+/CD3+（P＞0.05）and significantly increased Th2（P＜0.05）.Conclusion:Immunosuppression existed,in different extents,in patients of infiltrative pulmonary tuberculosis,tuberculous p leurisy,miliary pulmonary tuberculosis aswell as patientswith both pu lmonary tuberculosis and diabetes.Analysisof Th1,Th2 and CD4+/CD3+may be benefit for the judgments of disease conditions and therapeutic effects.

Pulmonary tuberculosis;Cellular immunology;Th;Cell polarization

R392.12 R378.91+1

A

1000-484X（2010）02-0178-05

①本文為蘇州市科學技術局資助項目[蘇財科字（2005）47號]

②蘇州大學醫學生物技術研究所,蘇州215007

胥 萍（1967年-）,女,碩士,副主任技師,主要從事感染免疫學研究;

及指導教師:張學光（1951年-）,男,教授,博士生導師,主要從事協同刺激分子的研究,E-mail:xueguangzh@yahoo.com.cn。

·分子與細胞免疫學·