HPLC檢測(cè)抗風(fēng)濕類中成藥中非法添加非甾體類化學(xué)物質(zhì)

李存金， 郭飛宇

(1.宜春市藥品檢驗(yàn)所，江西宜春336000;2.宜春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西宜春336000)

抗風(fēng)濕類中成藥中非法添加化學(xué)物質(zhì)主要有兩類，一類為抗炎、鎮(zhèn)痛類西藥，有萘普生、芬布芬、保泰松、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、布洛芬、吡羅西康及氨基比林等。另一類為激素類西藥，如醋酸強(qiáng)的松、磷酸地塞米松、強(qiáng)的松等［1］。萘普生、芬布芬、保泰松、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛及布洛芬是非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥物，抗炎效果顯著，解熱鎮(zhèn)痛效力強(qiáng)，有關(guān)各藥不良反應(yīng)報(bào)道較多，而且存在用藥風(fēng)險(xiǎn)［2］。因此各藥的應(yīng)用需要臨床醫(yī)生的指導(dǎo)?；颊叻梅欠ㄌ砑恿朔晴摅w類化學(xué)物質(zhì)的中成藥后，短期內(nèi)癥狀緩解，但長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看會(huì)對(duì)身體造成傷害。為了有效查處、打擊此類假藥的生產(chǎn)及銷售，參考有關(guān)文獻(xiàn)［3-7］，研究出HPLC法檢測(cè)抗風(fēng)濕類中成藥中非法添加非甾體類化學(xué)物質(zhì)萘普生、芬布芬、保泰松、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛及布洛芬的檢驗(yàn)方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀(G1314B VWD紫外檢測(cè)器，Kromasil C18柱 4.6 mm ×250 mm，P/N 07251967，Agilent LC系統(tǒng)化學(xué)工作站);Waters 1525型高效液相色譜儀(Waters 2487紫外檢測(cè)器，Diamonsil C18柱4.6 mm×250 mm，Cat.No 99603，Breeze3.0化學(xué)工作站);SK250LHC型超聲波清洗器;譜析通用TU1901紫外分光光度計(jì)。

萘普生對(duì)照品(批號(hào):100198-200403)、芬布芬對(duì)照品(批號(hào):100415-200301)、保泰松對(duì)照品(批號(hào):100481-200601)、雙氯芬酸鈉對(duì)照品(批號(hào):100334-200302)、吲哚美辛對(duì)照品(批號(hào):100258-200403)、布洛芬對(duì)照品(批號(hào):100179-200303)。以上對(duì)照品均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;水為二次重蒸餾水;甲醇為色譜純;其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，P/N 07251967);流動(dòng)相:甲醇－0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)pH至3.3)(66∶34);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):263 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取萘普生、芬布芬、保泰松、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛及布洛芬對(duì)照品適量，分別加甲醇超聲溶解并稀釋成濃度分別約為 1.0、1.0、2.5、2.5、2.5、2.0 mg/mL的對(duì)照品貯備液，分別精取上述對(duì)照品貯備液1、1、1、1、1、5 mL置25 mL量瓶中，加入流動(dòng)相定容至刻度。搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 若供試品為片劑、丸劑、顆粒劑，研細(xì)，稱取1次最大服用劑量，置具塞錐形瓶中，加25 mL丙酮-乙醇(9∶1)混合溶劑超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液蒸干，用甲醇20 mL分?jǐn)?shù)次溶解殘?jiān)⑥D(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò);若供試品為膠囊劑，取1次最大服用劑量?jī)?nèi)容物，研細(xì)，置具塞錐形瓶中，加25 mL丙酮-乙醇(9∶1)混合溶劑超聲提取10 min，濾過(guò)，濾液蒸干，用甲醇15 mL分?jǐn)?shù)次溶解殘?jiān)⑥D(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，膠囊殼［8］加熱水(70～80℃)10 mL溶解，用氯仿20 mL萃取，萃取液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，并入上述50 mL量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò);若供試品為口服液［9］，量取5 mL置25 mL量瓶中，加入約15 mL甲醇超聲10 min，待溫度與室溫平衡后，加入乙腈稀釋至刻度，超聲混勻，置冰箱中冷藏過(guò)夜，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系的考察 取濃度為 170.40、148.20、1 017.40、423.30、397.50 μg/mL 及 1 033.00 μg/mL 的萘普生、芬布芬、保泰松、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛及布洛芬對(duì)照品溶液貯備液 5、6、7、8、9、10 mL 分別置25 mL 量瓶中，分別用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。分別精取10 μL注入高效液相色譜儀，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得各組分的線性回歸方程:Y=13.934 37X－12.812 54，r=0.999 1;Y=29.803 12X+22.969 18，r=0.999 2;Y=18.415 43X+18.010 35，r=0.999 7;Y=16.229 99X+4.464 31，r=0.999 9;Y=28.727 66X+7.472 41，r=0.999 9;Y=7.456 15×10－1X+2.348 85，r=0.999 7;結(jié)果表明，萘普生、芬布芬、保泰松、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛及布洛芬在34.08～68.16 μg/mL、29.64 ～ 59.28 μg/mL、203.48 ～ 406.96 μg/mL、84.66 ～ 169.32 μg/mL、79.50 ～ 159.00 μg/mL、206.60～413.20 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果對(duì)照品6組份相應(yīng)峰面積的RSD值均小于0.2%，表明本法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品6份，照2.3項(xiàng)制備供試品，分別測(cè)定峰面積，結(jié)果平均含量分別為0.40%、0.35%、2.37%、0.98%、0.93%及2.41%，RSD(n=6)分別為0.9%、1.2%、0.4%、1.3%、0.5%及1.7%，表明本法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，照選定方法操作，在0、0.5、1、3、5、24 h 分別進(jìn)樣 10 μL 記錄峰面積，6 次測(cè)定 6 組份相應(yīng)峰面積的RSD均小于1.8%。表明本法穩(wěn)定性良好。

2.8 空白試驗(yàn) 本方法空白試驗(yàn)共測(cè)定了5個(gè)劑型，20批次抗風(fēng)濕類中成藥樣品，取樣品，照2.3項(xiàng)制備供試品，按樣品測(cè)定方法注入液相色譜儀，在對(duì)照品溶液成分色譜峰相應(yīng)的位置上，無(wú)其它色譜峰出現(xiàn)，見(jiàn)圖1，證明該色譜條件下，各供試品雜質(zhì)干擾小，各成分峰之間分離度好，6成分峰分離度依次為-、1.88、3.85、14.68、4.00 和 2.33。

圖1 HPLC色譜圖

2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取陰性的樣品適量，精密加入萘普生約5 mg、芬布芬約5 mg、保泰松約10 mg、雙氯芬酸鈉約10 mg、吲哚美辛約10 mg及布洛芬對(duì)照品約20 mg。照2.3項(xiàng)制備供試品，按樣品測(cè)定方法，測(cè)定其含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1～6。

表1 萘普生回收率結(jié)果

表2 芬布芬回收率結(jié)果

表3 保泰松回收率結(jié)果

2.10 樣品的檢定結(jié)果 取3批自制陽(yáng)性樣品［市場(chǎng)抽得風(fēng)濕定膠囊、舒筋活血片和小活絡(luò)丸(用高效液相證明其均不含各待測(cè)成分)，以上樣品按每克樣品各約加4.5 mg萘普生對(duì)照品、4.0 mg芬布芬對(duì)照品、30.0 mg保泰松對(duì)照品、10.0 mg雙氯芬酸鈉對(duì)照品、12.5 mg吲哚美辛對(duì)照品、25.0 mg布洛芬對(duì)照品，制作陽(yáng)性樣品，研磨均勻，制成3批陽(yáng)性樣品］試驗(yàn)，精密稱取的樣品適量，照2.3項(xiàng)制備供試品，按樣品測(cè)定方法試驗(yàn)，見(jiàn)圖1，測(cè)定其含量。結(jié)果見(jiàn)表7～9。

表4 雙氯芬酸鈉回收率結(jié)果

表5 吲哚美辛回收率結(jié)果

表6 布洛芬回收率結(jié)果

2.11 最低檢測(cè)限 本實(shí)驗(yàn)采用(S/N=3)確定本方法中萘普生、芬布芬、保泰松、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛及布洛芬的最低檢測(cè)限為 2.1 ng、1.2 ng、2.0 ng、3.4 ng、2.2 ng 及9.3 ng。

3 耐用性試驗(yàn)

3.1 專屬性試驗(yàn) 本方法共考察了5個(gè)劑型，20批次的抗風(fēng)濕類中成藥樣品，在對(duì)照品溶液成分色譜峰相應(yīng)的位置上，均無(wú)其它色譜峰出現(xiàn)，證明此方法專屬性好。

3.2 流動(dòng)相比例的選擇 流動(dòng)相甲醇－0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)pH至3.3)(66∶34)考察了(64∶36)、(66∶34)及(68∶32)3個(gè)比例，結(jié)果表明在本方法選定的流動(dòng)相比例微小的變動(dòng)情況下，雜質(zhì)成分能很好分離，各待測(cè)成分分離度均≥1.88，理論塔板數(shù)均≥9 759。因?yàn)榇郎y(cè)成分較多，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中甲醇的比例在66%基礎(chǔ)上增大會(huì)導(dǎo)致萘普生峰與芬布芬峰的分離度減小，而流動(dòng)相中甲醇的比例在66%基礎(chǔ)上減小會(huì)導(dǎo)致吲哚美辛峰和布洛芬峰的分離度減小。因此建議試驗(yàn)時(shí)選擇甲醇比例為66%，將使6成分同時(shí)獲得最佳的分離度，且不建議改變流動(dòng)相的比例。

表7 風(fēng)濕定膠囊自制陽(yáng)性樣品測(cè)定結(jié)果

表8 舒筋活血片自制陽(yáng)性樣品測(cè)定結(jié)果

表9 小活絡(luò)丸自制陽(yáng)性樣品測(cè)定結(jié)果

3.3 流動(dòng)相pH的選擇 流動(dòng)相甲醇－0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)pH至3.3)考察了0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液的pH 3.2、pH 3.3及pH 3.4 3個(gè)pH值，結(jié)果表明在本方法選定的pH 3.3值微小的變動(dòng)情況下，雜質(zhì)成分能很好分離，各待測(cè)成分分離度均≥1.89，理論塔板數(shù)均≥10 511。故本實(shí)驗(yàn)選擇流動(dòng)相pH為3.3。

3.4 色譜柱的選擇 我們使用以下不同牌號(hào)色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，均能取得滿意的分離效果與理論塔板數(shù)。

(1)Kromasil C18柱4.6 mm×250 mm;(2)Diamonsil C18柱4.6 mm ×250 mm;(3)Symmetry C185 μm，4.6 mm ×150 mm;(4)Hypersil ODS 2 5 μm，4.6 mm×250 mm。

4 討論

取各對(duì)照溶液照《中國(guó)藥典》2005版一部附錄IV A紫外-可見(jiàn)分光光度法，進(jìn)行光譜掃描。取萘普生、芬布芬、保泰松、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛及布洛芬對(duì)照品適量加甲醇超聲溶解并用流動(dòng)相稀釋成濃度分別約為 30、5、36、20、13 μg/mL及250 μg/mL的待測(cè)溶液。以相應(yīng)的溶劑作為空白對(duì)照，照紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定在200～400 nm范圍內(nèi)掃描。綜合考慮萘普生、芬布芬、保泰松、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛及布洛芬的吸收范圍，結(jié)合中成藥和保健品的成分復(fù)雜等情況，本方法選擇263 nm為分析波長(zhǎng)。

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