中藥胃腸安丸中5種蒽醌類成分的定量分析

張靜澤， 高文遠*， 王 磊，2， 馬超一

(1.天津大學藥物科學與技術學院，天津300072;2.天津中新藥業集團股份有限公司樂仁堂制藥廠，天津300380)

中藥胃腸安丸是由木香、沉香、枳殼(麩炒)、檀香、大黃、厚樸(姜制)、朱砂、麝香、巴豆霜、大棗(去核)、川芎等十一味中藥組成［1］，其中君藥:木香、沉香、檀香;臣藥:厚樸、枳殼、川芎;佐使藥:大黃、巴豆霜、麝香、大棗、朱砂。此方對于治療各種感染性、非感染性腹瀉以及胃腸功能性障礙所造成的惡心、嘔吐、腹脹、腹痛、腹瀉等癥狀效果顯著，并能改善胃腸功能;具有解痙、止瀉等作用。2005版中國藥典中只是以厚樸中的厚樸酚及和厚樸酚作為質量控制的指標，凌寧生等又對其中柚皮苷的含量進行了測定，通過測定10個批次胃腸安丸樣品發現其中柚皮苷含量不少于4.38 mg/g［2］。胃腸安丸組方獨特，止瀉不留邪，具有通因通用的特點，臨床用于治療腹瀉的效果顯著，能夠明顯緩解現代醫學中腹瀉型腸易激綜合癥的各種癥狀;同時胃腸安丸方對于胃腸道功能具有雙向調節的作用，藥理實驗結果證明胃腸安丸甲醇提取物能夠使正常小鼠的小腸推進率增加，使新斯的明致瀉小鼠的小腸推進率明顯降低［3］。因此，對于便秘型腸易激綜合癥的患者也有一定的治療作用。方中大黃的蒽醌類成分對小腸運動有明顯的促進作用，而對于方中具有瀉下活性的大黃中蒽醌類成分的含量尚無報道，由于中藥胃腸安丸對胃腸道功能具有雙向調節作用，因此本實驗采用RP-HPLC法對于胃腸安丸中所含的大黃蒽醌進行含量測定，一方面能夠為保證胃腸安丸用藥的安全有效提供了重要的數據支持，另一方面也為深入探討大黃作為佐使藥在方中的作用奠定基礎。

1 儀器與試劑

1.1 樣品與試劑 胃腸安丸由天津中新藥業集團股份有限公司樂仁堂制藥廠生產，批號為:WCAWD109002、D109004、D10909、D109010、D109020。對照品:蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚(含量測定用，中國藥品生物制品檢定所提供，批號:110756-200310、0757-200206、110756-200110、1107996-200310、1107580-200409)。乙腈、甲醇為色譜純、冰醋酸、氯仿為分析純(天津康科德醫藥化工有限公司)。

1.2 儀器 高效液相色譜儀(Waters2414型高效液相色譜儀;Waters2998紫外-可見檢測器);微量分析天平(CP225D，Sartourius Co.);Kromasil色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);微量進樣器(25 μL，Hamilton)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 流動相:A:甲醇，B:0.5%醋酸水溶液，梯度洗脫:0～20 min，A為65% ～85%;柱溫:35℃;流速:1 mL/min;檢測波長:254 nm。理論塔板數:各對照品對應色譜峰理論塔板數不小于4 000。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻得到蘆薈大黃素60 μg/mL、大黃酸90 μg/mL、大黃素100 μg/mL、大黃酚140 μg/mL、大黃素甲醚30 μg/mL的對照品溶液，分別吸取各對照品溶液2 mL混合均勻定容至10 mL，作為混合對照品貯備液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱定胃腸安丸粉末約1.0 g，置50 mL具塞三角瓶中，加甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足失重，濾過，精密量取續濾液20 mL，置于燒瓶中，揮去溶劑，加8%HCl溶液10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置于分液漏斗中，加少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷萃取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使之溶解，轉移至10 mL量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，過濾，取續濾液，即得，微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。另取處方藥材(缺大黃陰性)按照上述方法制備陰性對照品溶液。

2.4 線性關系的考察 精密吸取混合對照品溶液4、8、12、16、20 μL 進樣，按上述色譜條件測定，分別記錄峰面積。以大黃5種蒽醌進樣量(X)為橫坐標，相應峰面積積分值(Y)為縱坐標進行線性回歸，所得線性回歸方程分別為:蘆薈大黃素:Y=11 645X－22 533，r=0.999 8;大黃酸:Y=61 823X －18 028，r=0.999 9;大黃素:Y=82 864X+24 062，r=0.999 8;大黃酚:Y=11 911X －25 010，r=0.999 8;大黃素甲醚:Y=71 408X －5 671，r=0.999 9。

線性范圍分別為:蘆薈大黃素3.29～16.44 μg/mL;大黃酸9.08 ～45.40 μg/mL;大黃素 13.92～69.60 μg/mL;大黃酚14.60 ～73.00 μg/mL;大黃素甲醚2.91～14.55 μg/mL，在此范圍內樣品濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 按2.1項下色譜條件，取混合對照品溶液連續進樣6次，每次20 μL，依法測定，記錄分析樣品中大黃蒽醌各組分峰面積值，計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD值分別為0.72%、0.82%、0.72%、0.91%、1.03%(n=6)，結果表明該儀器精密度較好。

2.6 重復性試驗 取同一批號的胃腸安丸樣品按照供試品溶液的制備方法配制溶液，分別精密稱取5份，按2.1項下色譜條件，依法測定，記錄分析樣品中大黃蒽醌各組分峰面積值，計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD值分別為1.45%、0.81%、0.76%、1.33%、1.29%(n=5)，實驗結果表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取同一批號的胃腸安丸樣品按照供試品溶液的制備方法配制溶液，避光室溫放置，在0、2、4、6、8、10、12 h 分別進樣20 μL，按照2.1 項下色譜條件，依法測定，記錄與混合對照品相對應的各峰峰面積，計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚 RSD分別為 0.98%、0.87%、1.00%、0.85%、1.24%，所得結果的RSD值均小于2%，表明供試樣品溶液在12 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批胃腸安樣品約1.0 g，共6份，分別置上述具塞三角瓶中，精密吸取一定量混合蒽醌對照品溶液，混合均勻，按照2.1項下色譜條件，依法測定，記錄峰面積，計算回收率，結果見表1。

表1 胃腸安丸中5種蒽醌類化合物加樣回收率試驗Tab.1 The recovery test results of 5 kinds of anthraquinones in Weichang’an Pill

2.9 空白試驗 除大黃外按處方量稱取其他藥味，按處方工藝制成不含大黃的制劑，制成缺大黃的陰性空白對照液，按照2.1項下色譜條件，依法測定，記錄各峰峰面積。對照品、空白對照和供試品的HPLC圖見圖1，由此證明其他藥材中的所含的成分在此檢測條件下并不影響大黃蒽醌的測定。

2.10 樣品測定 取5批胃腸安丸，按2.3項下供試品溶液制備方法制成供試品溶液，每批制備3份。精密吸取供試品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，進行測定，按照5種蒽醌的標準曲線分別計算，結果見表2。通過對5批胃腸安丸中蒽醌類成分進行檢測，胃腸安丸中5種蒽醌的總量不少于為1.03 mg/g。

3 討論

胃腸安丸由十一味中藥組成，其君藥中木香的主要活性成分木香烴內酯和去氫木香內酯具有松弛平滑肌和解痙的作用，能夠明顯抑制小鼠腸蠕動［4］;臣藥厚樸中主要活性成分厚樸酚對豚鼠末段結腸的推進具有明顯抑制作用，提示其具有止瀉作用，為中藥厚樸治療下消化道疾病的藥理學基礎之一;小腸炭末推進實驗也證明厚樸酚能明顯抑制小腸炭末推進率，說明其對小鼠的小腸運動具有抑制作用;還能明顯減少番瀉葉與蓖麻油引起的小鼠濕糞增加，說明其對番瀉葉引起的腸道蠕動與分泌增加有明顯抑制作用，對蓖麻油水解成蓖麻酸后引起水和電解質轉運發生改變的過分泌反應有抑制作用，認為是胃腸安發揮止瀉作用的物質基礎之一［5］。然而對于方中具有瀉下活性的大黃中蒽醌類成分的含量尚無報道，由于胃腸安對于胃腸道功能具有雙向調節作用，因此對于具有瀉下活性的大黃蒽醌含量進行測定對于評價胃腸安丸的質量具有指導意義。

圖1 胃腸安丸HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standard solution(A)，Weichang’an Pill sample solution(B)and negative sample(C)A.混合對照品 B.胃腸安供試品 C.陰性樣品

表2 不同批次樣品中5種蒽醌的含量測定結果(n=3)Tab.2 Contents of 5 kinds of anthraquinones in different samples(n=3)

胃腸安丸藥味多，所含化合物種類繁多，在選擇流動相比例時，考察了乙腈－0.5%醋酸水溶液，甲醇－0.5%醋酸水溶液等度與梯度條件下樣品分離效果，在乙腈作為流動相時，調整流動相比例很難在短時間內將蘆薈大黃素和大黃酸的兩個色譜峰分開。多數對于復方中大黃蒽醌HPLC測定的色譜條件是采用甲醇 －0.1%磷酸溶液(85∶15)［6］，然而在對胃腸安丸進行測定時等度條件下分離效果不理想，因此采用甲醇－0.5%醋酸水溶液梯度洗脫分離效果良好，而且分析時間短，測定能夠在30 min內完成。試驗結果表明，該方法能夠簡單、快速、準確的測定胃腸安丸中蒽醌類成分的含量。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:518.

［2］凌寧生，楊 瑾，律兆榮，等.HPLC法測定胃腸安丸中柚皮苷［J］.中草藥，2005，36(12):1815-1816.

［3］Hu Jing，Gao Wenyuan，Ling Ningsheng，et al.Antidiarrhoeal and intestinal modulatory activities of Wei-Chang-An-Wan extract［J］.J Ethnopharmacol，2009，125:450-455.

［4］張國華，王賀玲.木香對胃腸運動作用的影響及機制研究［J］.中國現代實用醫學雜志，2004，3(13):24-26.

［5］朱自平，張明發，沈雅琴，等.厚樸對消化系統的藥理作用［J］.中國中藥雜志，1997，22(11):686.

［6］魏 萍，黃旭騰.黃芍顆粒中5種蒽醌成分的HPLC測定［J］.中成藥，2009，31(12):附1-3.