與HLGR腸球菌相關的氨基糖苷修飾酶的研究進展

劉 晶

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院檢驗科,北京 100026）

腸球菌是條件致病菌,廣泛存在于自然界,常棲居在人、動物的腸道和女性生殖道,很少引起嚴重的感染。近年來,隨著廣譜抗生素的大量使用,腸球菌成為醫院感染的三大病原菌之一,能夠引起心內膜炎、菌血癥和尿路感染等[1]。對于嚴重的腸球菌感染臨床上常采用細菌細胞壁活性抗菌藥物,如青霉素或糖肽類藥物,與氨基糖苷類抗生素聯合治療[2]。但當腸球菌獲得氨基糖苷類耐藥基因介導產生氨基糖苷類修飾酶,會對高濃度氨基糖苷類產生耐藥性,從而失去與細菌細胞壁活性抗菌藥物的協同作用[2],加大了治療的難度。在耐藥菌中以慶大霉素高水平耐藥腸球菌(HLGR）為主,故全面了解腸球菌的耐藥機制及耐藥性的傳遞特性,對于指導臨床合理使用抗生素,新抗生素的研發起著重要作用。

1 慶大霉素修飾酶及其基因特點

根據美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS）建議,腸球菌對慶大霉素高耐藥的標準是MIC〉500 μ g/ml。氨基糖苷類修飾酶(AME）是造成高耐藥產生的主要原因。目前報道的高耐慶大霉素的氨基糖苷修飾酶主要有以下幾種:

1.1 雙功能酶 AAC(6′）-APH(2″）雙功能酶 AAC(6′）-APH(2″）是目前為止發現的最重要的AME,腸球菌對慶大霉素高水平耐藥幾乎都由此酶介導,由耐藥基因aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia 編碼[3],普 遍認 為 aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia基因存在腸球菌、金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌中,基因序列號M13771,開放閱讀框(ORF）1 437 bp。Joseph等證實aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia是2個基因的融合體,只含有一個起始密碼子和一個終止密碼子。這兩種基因在結構上是完整統一的,但各自發揮作用而不增強對方的耐藥活性。AAC(6′）-APH(2″）可以介導對慶大霉素、妥布霉素、地貝卡星、奈替米星、阿米卡星、異帕米星及福提米星的耐藥,但鏈霉素不受影響[4]。由于AAC(6′）-APH(2″）雙功能酶使腸球菌對除鏈霉素以外的幾乎所有氨基糖苷藥物高度耐藥(MIC〉500 μ g/ml）,因此對高耐氨基糖苷類腸球菌的篩選,一般僅用慶大霉素和鏈霉素即可,如腸球菌產AAC(6′）-APH(2″）雙功能酶則消除了這些抗生素與作用于細胞壁藥物的協同殺菌作用。

1.2 氨基糖苷磷酸轉移酶APH(2″）-Ic:aph(2″）-Ic基因最初發現于雞腸球菌中,隨后在屎腸球菌和糞腸球菌中也被發現[2]。攜帶aph(2″）-Ic基因的腸球菌對慶大霉素呈中等水平耐藥,但是能夠破壞氨芐西林與慶大霉素的協同作用[5]。因此,應用濃度為500 μ g/ml慶大霉素檢測其耐藥基因(破壞與作用于細胞壁藥物的協同作用）,攜帶aph(2″）-Ic基因的腸球菌就被漏檢,可能錯誤地認為氨基糖苷與作用于細胞壁藥物有協同作用。另一方面,因為256μ g/ml和 500 μ g/ml之間呈2倍的稀釋濃度關系,攜帶aph(2″）-Ic基因的菌株在使用500μ g/ml慶大霉素篩查試驗隨時可以輕微的生長。這些菌株可能被錯誤地認為攜帶aac(6＇）-Ie-aph(2″）-Ia基因,這樣,錯誤地認為對多種氨基糖苷耐藥,其實他們對于氨芐西林與阿米卡星、奈替米星或者地貝卡星的協同效應是敏感的。

1.3 氨基糖苷磷酸轉移酶APH(2″）-Id APH(2″）-Id由Susan F.Tsai等[6]于1998年首次報道,是一個新發現的氨基糖苷修飾酶,由 aph(2″）-Id編碼,基因序列號:AF016483,ORF是906 bp。APH(2″）-Id可以修飾慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素、耐替米星和地貝卡星,而且MIC均大于2 000 mg/L。在協同殺菌試驗中,對僅含有APH(2″）-Id的腸球菌,未檢測到氨芐西林加慶大霉素或耐替米星的協同作用,但同樣劑量的氨芐西林加阿米卡星或新霉素卻顯示了協同殺菌作用。

1.4 氨基糖苷磷酸轉移酶APH(2″）-Ib APH(2″）-Ib由Susan J.Kao等[7]于2000年首次報道,APH(2″）-Ib是在屎腸球菌SF11770中發現的一個高耐慶大霉素的基因,基因序列號是:AF207840,ORF是897 bp。APH(2″）-Ib介導了腸球菌對慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、奈替米星和地貝卡星高水平耐藥,消除了氨芐西林與慶大霉素的協同殺菌作用。攜帶APH(2″）-Ib的菌株在理論上應對氨芐西林與阿米卡星的聯合用藥敏感,在對屎腸球菌SF11770的協同殺菌試驗中,氨芐西林與慶大霉素無協同作用,但氨芐西林與阿貝卡星顯示了一定的協同作用,其在體內的有效性需進一步證實。

1.5 氨基糖苷乙酰轉移酶AAC(6′）-Im 在屎腸球菌SF11770種發現的一種新的耐藥基因[8],其位于aph(2″）-Ib下游44bp處,而且aph(2″）-Ib和aac(6′）-Im 是各自獨立的2個開放閱讀框(ORF）,擁有各自的核糖體結合位點。aac(6′）-Im 編碼產生 AAC(6′）-Im,與雙功能酶中的 AAC(6′）-Ie的結構域 80%相似,56%相同。當 aph(2″）-Ib和 aac(6′）-Im同時存在時,對某些氨基糖苷類耐藥性明顯比各自單獨存在時要高。

1.6 氨基糖苷磷酸轉移酶APH(2″）-Ie APH(2″）-Ie是由瞿婷婷等[9]于2006年發現并報道,APH(2″）-Ie是在鉛黃腸球菌HZ95中發現的最新的高耐慶大霉素的基因,基因序列號:AY677166,ORF是905 bp。研究發現,在屎腸球菌和鶉雞腸球菌中也檢測到這個基因。APH(2″）-Ie可導致對慶大霉素及奈替米星的高水平耐藥,但并不介導鏈霉素、阿米卡星的耐藥性。

2 耐藥基因的轉移

氨基糖苷類基因借助于轉座子、質粒等可移動元件在同種或不同種細菌間傳播,抗菌藥物不合理應用是導致耐藥相關基因傳播的重要原因。

2.1 質粒介導的耐藥性轉移

目前,研究較多的是性信息素應答性質粒,主要存在于糞腸球菌中,并在糞腸球菌間傳遞,菌體間的轉移頻率可高達100-10-2(每個供體菌所對應的轉化結合子的數目）。另一種與耐藥質粒相關的質粒是多宿主質粒,它可以跨種屬進行質粒的轉移,但轉移頻率較低。最近,在屎腸球菌中還發現了一種質粒pMG1(65.1 kb）,它既有別于信息素應答性質粒,不被信息素誘導;也有別于多宿著質粒,轉移頻率達到10-4。pMG1可在糞腸球菌間、屎腸球菌間、糞腸球菌與屎腸球菌間、屎腸球菌與海瑞腸球菌間轉移,顯示其在腸球菌間有很強的轉移能力。

2.2 轉座子介導的耐藥性轉移

轉座子是位于染色體或質粒上的一種可以獨立于質粒存在的可轉移性基因序列。最簡單的轉座子是一個插入序列(IS）,它含有編碼轉座過程必須遺傳信息的基因,如:轉座酶基因。復合型轉座子有兩端的插入序列及中心區的獲得性基因,如:耐藥基因。在腸球菌中發現了多種含有 aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia并類似于Tn4001的復合型轉座子,如Tn5281及其類似結構、缺陷型Tn4001樣結構、Tn5384等。

Tn5281[10]:1991年Hodel-Christian等[11]首先在糞腸球菌中發現Tn5281,之后在屎腸球菌、鶉雞腸球菌和棉子糖腸球菌等多種腸球菌中也有發現。復合型轉座子Tn5281與金黃色葡萄球菌Tn4001和無乳鏈球菌Tn3706具有相同的結構,由兩個互為反向重復序列的插入序列IS256連接在雙功能的氨基糖苷修飾酶基因aac(6'）-Ie-aph(2”）-Ia兩側構成。IS256編碼的轉座酶能識別IS256末端的反向重復序列,催化轉座子的移動。轉座子Tn5281的變異型較多,主要表現為左側或右側的 IS256缺失型、Tn5281-IS257雜交型和缺陷型Tn4001。腸球菌中HL GR基因主要位于Tn5281上[20],轉座子可整合于接合質粒上,從而促進了HLGR基因在菌株間的散播。

Tn5384[12]:是糞腸球菌CH116中發現的長26 kb的轉移元件,是第1個報道的雙功能修飾酶基因與其他耐藥基因共轉移的例子。此轉座子結構中共有3個IS256,其中2個位于雙功能修飾酶基因兩側,形成類似Tn4001的結構,第3個IS256位于最左端插入位點下游23 kb處,它與第2個IS256中間可能有耐紅霉素基因定位。

Tn5385[13]:是整合入糞腸球菌CH19和CH116染色體上的1個更大的轉座子,它含有多種轉座子樣結構(Tn5281、Tn5384、Tn4001、Tn552）及插入序列(IS256、IS257、IS1216）,整個復合結構的兩端為正相重復的IS1216。含有多種耐藥基因:aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia、ant(6′）-Ia、β -內酰胺酶 基因,以及對紅霉素、升汞、四環素、米諾環素的耐藥基因。Tn5385轉移到糞腸球菌受體菌中的頻率低,且通過染色體重組出現兩種轉移菌類型。

Tn924[14]:是位于糞腸球菌SF350染色體上的一個高水平慶大霉素耐藥轉座子,可通過共存的接合質粒轉移,不含質粒的只在染色體上有Tn924的菌株不能轉移其耐藥性。基因全長27 kb,可能含有類似截斷的Tn4001-IS257雜交結構。

3 耐藥機理研究的實驗室方法

根據NCCLS的標準,腸球菌在含慶大霉素 500 μ g/ml的BHI肉湯中,經24小時培養,有細菌生長或瓊脂培養基中有超過1個菌落生長,即為高水平耐藥。

3.1 修飾酶活性檢測氨基糖苷修飾酶的酶活性檢測一般采用磷酸纖維素膜結合測定法(phosphocellulose paperbinding assay）,不同放射性元素標記的乙酰輔酶A、ATP在修飾酶的作用下,將放射性元素轉移到吸附于磷酸纖維素膜的慶大霉素上,通過放射性計數檢測酶的活性。

3.2 耐藥基因的檢測通過 PCR[15,21]、探針雜交[16,20]等方法進行。

3.3 接合轉移試驗性信息素介導的高頻質粒轉移試驗可在BHI肉湯中進(broth mating法）,對于非信息素介導的質粒或轉座子轉移試驗可借助固體表面進行。

3.4 轉座子的檢測采用兩種方法:①Long-PCR[17,20]:是通過長距離PCR限制性片段長度多態性(L-PCR-RFLP）,分析轉座子結構變異。②巢氏PCR(Nested-PCR）技術[18]。

4 結束語

隨著氨基糖苷類耐藥基因的廣泛流行,特別是腸球菌中的aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia基因,使得氨基糖苷類藥物聯合應用治療受到限制。目前,大部分腸球菌對慶大霉素高水平耐藥,絕大多數對鏈霉素也高水平耐藥,這就導致腸球菌實際上對臨床上所有常用的氨基糖苷類藥物都產生耐藥。因此,要求加強新藥的研究、開發。阿比卡星是一種新的氨基糖苷類藥物,是迪比卡星的衍生物,目前只在日本用來治療對慶大霉素和新青霉素耐藥的金黃色葡萄球菌感染,阿比卡星受雙工能酶AAC(6′）-APH(2″）介導影響的幾率要比慶大霉素小的多,因此在治療一些含有 aac(6′）-Ie-aph(2″）-Ia基因的腸球菌感染中可能有用[2]。利奈唑胺是一種新的化學結構惡唑烷酮類藥物,有望用來治療嚴重的腸球菌感染[19]。

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