根癌農桿菌介導煙曲霉遺傳轉化的研究

張艷華,賀 丹,王 麗*

(1.吉林大學白求恩醫學院,吉林 長春 130021;2.吉林大學植物科學學院,吉林 長春 130062）

煙曲霉(Aspergillus fumigatus）是自然界普遍存在的絲狀真菌,也是重要的條件致病菌。近年來,隨著抗生素、抗腫瘤藥物、糖皮質激素的廣泛應用,器官、骨髓移植、介入治療等新型診治技術的開展,及惡性血液病和艾滋病等免疫受損人群的擴大,由煙曲霉引起的系統性感染,即侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis,IA）發病率不斷升高,僅次于假絲酵母(Candida）引起的感染,病死率達60%-100%,成為白血病和骨髓移植等重癥免疫受損患者死亡的主要原因[1,2]。

人們對煙曲霉的生物學特性,包括生長率、耐熱性、有性階段、代謝產物、致病性、耐藥性等還沒有深入了解。1998年英國曼徹斯特大學Dr.David Denning協調多國科學家,以臨床分離煙曲霉菌株Af293為對象,啟動了煙曲霉基因組測序項目,已于2005年完成[3],為研究煙曲霉生物學特征,探討致病、耐藥機制及尋找藥物靶標提供了條件。

1 煙曲霉基因組概述

煙曲霉基因組序列信息表明,Af293包括8條大小從1.8-4.9Mb的染色體,共29.4 MB,G+C含量49.9%。預測有9926個基因編碼蛋白質,基因的平均長度為1 431 bp,大約有三分之一基因的功能是未知的。與構巢曲霉和米曲霉基因組相比較,發現約500個煙曲霉獨特基因。另外發現,煙曲霉含有一個用于異宗配合的完整補體,一個與酵母完全不同的細胞壁組裝過程,至少有28個基因簇編碼的蛋白質參與次級代謝和產生毒素,至少有168個藥物、毒素和大分子的外排泵[4]。

雖然通過計算機分析對基因功能在理論上進行了推測,但仍有大量未知功能基因需要確定。目前,結合全基因組序列信息,利用從位點到表型的反向遺傳學策略,構建覆蓋全基因組的突變體庫,已廣泛用于功能基因組學研究。

2 根癌農桿菌介導的真菌遺傳轉化

近年來發展的根癌農桿菌介導的遺傳轉化(Agrobacterium tumefaciens Mediated Transformation,ATMT）技術,是獲得突變體的有利工具。根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens）是一種革蘭氏陰性土壤桿菌,含有腫瘤誘導(Tumor Inducing,Ti）質粒。Ti質粒上包括轉移DNA(T-DNA）區、毒性區(Vir區）以及冠癭堿代謝基因編碼區。T-DNA兩端是兩個長25 bp的同向重復序列,分別稱為左邊界(LB）和右邊界(RB）。當植物受到傷害時,Ti質粒在Vir基因和其它蛋白質的協助下,將TDNA插入到植物染色體中。為使Ti質粒適于生物技術的需要,現已對Ti質粒進行了改造,發展了雙元載體系統,即由兩個分別含有T-DNA和Vir區的相容性質粒組成[5]。目前,根癌農桿菌已成功用于植物細胞的遺傳轉化。

1995年Bundock等人[6]利用ATMT技術轉化釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae）,開創了農桿菌介導真菌遺傳轉化的先河。隨后,該技術也被用于其它絲狀真菌的轉化,如粗糙脈孢霉(Neurospora crassa）、瑞氏木霉(Trichodema Reesei）、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea）、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysprum）、鐮形刺盤孢霉(Colletotrichum falcatum）、巴克斯霉(Backusella lamprospora）,等[7-10]。這些開創性的工作為絲狀真菌遺傳轉化開辟了一條全新而有效的途徑。隨著ATMT技術的逐漸成熟,該方法也已用于黑曲霉(Aspergillus niger）,泡盛曲霉(Aspergillus awamori）和巨大曲霉(Aspergillus giganteus）等曲霉遺傳轉化的研究[11,12]。

ATMT豐富了絲狀真菌的轉化技術,與傳統的轉化方法(如脂質體轉化法、電轉化法、PEG法等）相比,具有很多優點[11,12,13]:(1）轉化受體類型多:傳統真菌轉化方法,如電轉化法,需制備原生質體,不同真菌原生質體制備方法差異很大。而ATMT轉化的受體材料類型多,既可用原生質體、也可用萌發的孢子、分生孢子、菌絲體,甚至是真菌的子實體均可;(2）轉化效率高:對大多數絲狀真菌而言,ATMT法比其他轉化方法的效率高得多。利用ATMT轉化泡盛曲霉(A.awamori）的效率比PEG法高600倍,球毛殼菌(Chaetomium globosum）和哈茨木霉(Trichoderma harzianum）進行轉化也得到了類似的結果;(3）單拷貝的T-DNA插入:實驗表明,80%的F.oxysporum的ATMT轉化子、60%的M.grisea的ATMT轉化子都是單拷貝插入,便于對突變體進行遺傳分析;(4）轉化子穩定:ATMT轉化米根霉(Rhizopus oryzae）所獲得的轉化子,其有絲分裂的穩定性是100%,而利用PEG法獲得的轉化子,其有絲分裂只有0.01-0.5%是穩定的;(5）方法簡便:不需復雜的設備儀器,采用質粒拯救(plasmid resuce）或TAIL-PCR即可克隆出T-DNA所標簽的序列。

基于上述優點,使ATMT方法在絲狀真菌轉化中得到越來越廣泛的應用。一方面,構建目標基因的敲除載體,利用農桿菌介導的遺傳轉化,T-DNA以同源重組的方式整合到宿主基因組,成為基因敲除或替換的有效手段;另一方面,當根癌農桿菌T-DNA中不存在與受體菌染色體同源序列時,TDNA隨機插入到宿主染色體基因組中,獲得插入突變,利用T-DNA標簽快速分離標記的基因,在絲狀真菌功能基因研究中非常有用。

目前,該技術已用于稻瘟病菌、木霉、鐮刀菌等多種重要絲狀真菌的T-DNA插入突變體庫的構建,并克隆了一些與致病、生長相關的基因[8,9,14]。

3 根癌農桿菌介導的煙曲霉遺傳轉化

在煙曲霉基因組序列完成之際,該技術成為煙曲霉功能基因組研究的重要手段。在隨機插入突變方面,Janyce等[15]將煙曲霉分生孢子(1×107個/ml）和攜帶有潮霉素抗性質粒的根癌農桿菌(OD600=0.6）按一定比例混合,24℃誘導培養48小時,然后轉移至篩選培養基,篩選轉化子,其轉化效率可達100個轉化子/107個孢子。獲得的轉化子大多數以單拷貝T-DNA的形式隨機整合,且轉化子后代有絲分裂性狀穩定。

在基因定向整合方面,Janyce等[15]利用雙元載體pDHt/sk,以煙曲霉alb1為靶基因(alb1基因編碼聚酮合成酶,該基因缺失將導致煙曲霉產生白化的分生孢子）,構建了含有潮霉素抗性的alb1基因敲除載體,并導入農桿菌EHA105中。將農桿菌EHA105與煙曲霉B-5233分生孢子共培養,獲得大量轉化子。其中66%轉化子產生白化的分生孢子,34%轉化子產生藍綠分生孢子,遺傳轉化效率遠遠高于原生質體法。

李若瑜等[16]以 pyrG為篩選標記,利用雙元載體pDHt/sk構建煙曲霉fap1和sho1基因的打靶載體,利用根癌農桿菌與煙曲霉分生孢子共培養,篩選轉化子,fap1基因、sho1基因同源重組率分別為44%和35%。

4 結束語

在未來一段時期,真菌感染的發生仍然會呈上升趨勢,開展高危人群真菌感染的前瞻性研究,尤其是病原真菌的基因組學和蛋白組學研究,分析危險因素,闡明其生物學特性,發掘致病基因和耐藥基因,開發強有力的抗真菌藥物,將對真菌感染的防治發揮重要作用。

上述研究表明,ATMT技術是煙曲霉隨機插入突變和基因定向整合的有力工具。由此,利用農桿菌介導的T-DNA插入突變,快速構建覆蓋煙曲霉基因組的突變體庫,結合全基因組序列信息,是進行煙曲霉功能基因組學研究的有效方法。隨著越來越多的絲狀真菌全基因組序列分析完成,ATMT必將成為絲狀真菌遺傳的有效手段,特別是在病原真菌的基因克隆和功能鑒定方面具有廣闊的應用前景。

[1]Montoya JG,Giraldo LF.Infectious complications among 620 consecutive heart transplant patients Stanford University Medical Center[J].Clin Infect Dis,2001,33(5）:629.

[2]Warnock DW.Trends inthe epidemiology of invasive fungal infections[J].Med Mycol,2007,48(1）:1.

[3]Nierman WC,Pain A,Anderson MJ,et al.Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus[J].Nature,2005,438(7071）:1151.

[4]Galagan JE,Calvo SH,Cuomo C,et al.Sequencing of Aspergillus nidulans and comparative analysis with A.fumigatus and A.oryzae[J].Nature,2005,438(7071）:1105.

[5]Hiei Y,Ohta S,Komari T,et al..Efficient transformation of rice mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J].Plant,1994,6:271.

[6]Bundock P,Dulk-Ras A,Beijersbergen A,et al.Trans-kingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae[J].EMBO,1995,14:3206.

[7]de-Groot MJ,Bundock P,Hooykaas PJ,et al.Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of filamentous fungi[J].Nat Biotechnol,1998,16(11）:1074.

[8]Junhyun J,Sook YP,Myoung HC,et al.Genome-wide functional analysis of pathogenicity genes in the rice blast fungus[J].Nat Genet,2007,39(4）:561.

[9]Maruthachalam K,Nair V,Rho HS,et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation in Colletotrichum falcatum and C.acutatum[J].Microbiol Biotechnol,2008,18(2）:234.

[10]Nyilasi I,Papp T,Csernetics A,et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of the zygomycete fungus Backusella lamprospora[J].Basic Microbiol,2008,48(1）:59.

[11]Meyer V,Mueller D,Strowig T,et al.Comparison of different transformationmethods for Aspergillus giganteus[J].Curr Genet,2003,43(5）:371.

[12]Caroline B M,Paul JJ Hooykaas,et al.Agrobacterium-mediated transformation of the filamentous fungus Aspergillus awamori[J].Nature,2008,3(10）:1671.

[13]Takahara H,Tsuji G,Kubo Y,et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation as a tool for random mutagenesis of Colletotrichum trifolii[J].Gen Plant Pathol,2004,70:93.

[14]Zhong YH,Wang XL,Wang TH,et al.Agrobacterium-mediated transformation(AMT）of Trichoderma reesei as an efficient tool for random insertional mutagenesis[J].Appl Microbiol Biotechnol,2007,73:1348.

[15]Janyce A,Sugui,Chang YC,et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Aspergillus fumigatus:an efficient tool for insertional mutagenesis and targeted gene disruption[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(4）:1798.

[16]Ma Y,Qiao JJ,Li RY,et al.The Sho1 Sensor Regulates Growth,Morphology,and Oxidant Adaptation in Aspergillus fumigatus but Is Not Essential for Development of Invasive Pulmonary Aspergillosis[J].Infect Immun,2008,76(4）:1695.