誘導性多潛能干細胞（iPS）的應用進展

陳要臻，安群星，陳曉鵬，穆士杰，張獻清，余瑞

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誘導性多潛能干細胞（iPS）的應用進展

陳要臻，安群星，陳曉鵬，穆士杰，張獻清，余瑞

710032 西安，第四軍醫大學西京醫院輸血科

誘導性多潛能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）自問世以來，取得了突飛猛進的發展。2006 年 8 月，Takahashi 和 Yamanaka[1]確定誘導 iPS 細胞生成的 4 種轉錄因子是：Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4。2007 年 11 ~12 月，日本的 Yamanaka 小組用這 4 種轉錄因子組合將人的體細胞重編程為 iPS 細胞[2]。美國的 Thomson 小組用 Oct-4、Sox2、Nanog和Lin28 這 4 種轉錄因子也將人的體細胞重編程為 iPS 細胞[3]。由于iPS 細胞與胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）的生物學特性非常相似，又不涉及倫理道德問題，因此具有重要的臨床應用潛能。iPS 細胞的未來是可以安全用于臨床的治療型干細胞，本文就iPS 細胞臨床應用的安全性與應用進展做一綜述，并探討其應用前景。

1 iPS 細胞的安全性

由于iPS 細胞有重要的臨床應用潛能，因此將 iPS 細胞用于臨床治療前，要嚴格分析它的安全性。由于 c-Myc 是致癌基因，且 Klf4 也有一定的致癌能力[4-5]。為了提高iPS 細胞的安全性，科學家們做了很多研究，總結起來，主要有以下幾點：

⑴避免使用致癌基因。Wernig 等[6]和 Nakagawa 等[7]不用 c-Myc 因子，只用 Oct4、Sox2 和 Klf4 這 3 個轉錄因子來誘導 iPS 細胞，并獲得了成功。Feng 等[8]用 Essrb 替代 c-Myc 和 Klf4 這兩個因子，與 Oct4 和 Sox2 共同作用把胎鼠成纖維細胞重編程為 iPS 細胞。組蛋白去乙酰化酶抑制劑 VPA 與 Oct4 和 Sox2 兩個因子也可把人的成纖維細胞誘導成 iPS 細胞[9]。Thomson 小組[3]用Oct-4、Sox2、Nanog 和 Lin28 誘導人的成纖維細胞為 iPS 細胞也可以避開c-Myc 和 Klf4 的致癌性。

⑵利用某些體細胞中表達的內源因子，減少轉錄因子的使用數目。比如神經干細胞（neural stem cells，NSCs）和神經前體細胞（neural progenitor cells，NPCs）可表達 Sox2 因子，只用 Oct4 和 Klf4 兩個因子就可以誘導 NSCs 和 NPCs 形成 iPS 細胞[10-11]。Kim 等[12]還發現 NSCs 表達 Sox2 和 Klf4 兩種因子只用 Oct4 一個因子就可以將成年小鼠的 NSCs 重編程為 iPS 細胞。

⑶將已整合的外源基因從 iPS 細胞的基因組中清除。使用基因編碼技術使得外來基因兩端存在特有標志，誘導成功后，“Cre”酶識別這種標志去除 iPS 細胞中的外源重編程因子以得到沒有外源因子的 iPS 細胞[13-14]。但是，Cre 介導的外源因子切除后，載體的一段 DNA 還留在插入位點上。而piggyBac（PB）轉座子系統可將外源 DNA 徹底清除，不會引起基因組 DNA 序列的任何變化[15]。用 PB 轉座子介導表達 4 個 Yamanaka 因子誘導 iPS 細胞，然后在這些 iPS 細胞中瞬時表達轉座酶以切除外源 Yamanaka 因子。與“Cre”比較而言，PB 轉座子系統是一種更安全的方法。

⑷小分子化合物替代轉錄因子。不僅外源基因有致癌的安全隱患，用于介導外源基因表達的逆轉錄病毒或慢病毒也有潛在的安全問題。不管是逆轉錄病毒，還是慢病毒，都會把外源基因整合到基因組 DNA 中，這就有可能引起插入突變。為了減少或避免插入突變，有的實驗室進行了小分子化合物的篩選，希望找到可替代這 4 個重編程因子的小分子化合物。組蛋白甲基轉移酶G9a 的抑制劑 BIX-01294 最早被發現可替代 Oct4，與其余的 3 個 Yamanaka 因子一起誘導 NPCs 形成 iPS 細胞[16]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑 VPA 與前面已經提到 Essrb 均可替代 c-Myc 和 Klf4 這兩個因子。

⑸利用腺病毒介導。為了完全避免整合性病毒或轉座子的使用，只在體細胞中瞬時表達 Yamanaka 因子以誘導 iPS 細胞的形成。Stadtfeld 等[17]嘗試用腺病毒（不整合入基因組 DNA）來介導 Yamanaka 因子的表達來誘導 iPS 細胞。盡管他們成功獲得了 iPS 細胞，并且沒有外源基因的插入，但誘導 iPS 細胞的效率很低。

⑹利用脂質體介導。Okita 等[18]采用脂質體介導的轉染方法來誘導 iPS 細胞。但是由于 iPS 細胞的形成大約需 10 -12 d 持續表達 Yamanaka 因子[19]，因此這種方法要求反復轉染細胞以保證 Yamanaka 因子在重編程的前期持續表達，同腺病毒介導的方法一樣，誘導 iPS 細胞的效率很低。Yu 等[20]將Yamanaka 基因添加到質粒的 DNA 環中（質粒通常存在于細胞的染色體之外），然后用核轉染的方法將這些質粒介入到人包皮細胞中。在質粒中的基因所表達的蛋白質會將細胞重新編程并使其成為 iPS 細胞。這些 iPS 細胞在接著的幾輪細胞分裂中會開始失去這些質粒，這樣就可以分離出不含質粒的 iPS 細胞。

⑺直接導入重編程因子的蛋白，來誘導 iPS 細胞的形成。在重編程因子蛋白上連接細胞穿膜肽（cell-penetrating peptide），這樣的融合蛋白可穿透細胞膜進入細胞內部，執行其重編程的功能。蛋白誘導的小鼠和人 iPS 細胞都已實驗成功[21-22]，但是誘導 iPS 細胞的效率很低，而且蛋白容易失活。因為蛋白直接誘導 iPS 細胞在重編程過程中不會涉及任何的遺傳修飾，所以，從 iPS 細胞臨床應用的安全角度來看，它是目前最安全的方法，但是需要進一步提高其誘導效率。

⑻尋找安全性較高的 iPS 供體細胞。研究表明 iPS 細胞的供體細胞對于腫瘤形成有不同敏感性。Aoi 等[23]比較不同來源的 iPS 小鼠后代的成瘤趨勢和死亡率，發現由 MEF 細胞衍生得到的 iPS 小鼠的成瘤趨勢比從肝臟細胞和胃表皮細胞誘導得到的 iPS 細胞形成的小鼠要高很多，且前者的死亡率更高，存活時間短。Miura 等[24]利用小鼠胚胎的皮膚細胞、成年小鼠的胃細胞、尾巴的皮膚細胞以及肝臟細胞培育出的 36 種 iPS 細胞移植后使實驗鼠出現腫瘤的危險性存在很大差異。結果顯示，被植入分化細胞來自成年小鼠尾巴皮膚細胞的實驗鼠中有 83%體內出現了腫瘤；被植入分化細胞來自于小鼠胚胎皮膚細胞的實驗鼠中只有 8%出現腫瘤；而如果實驗鼠移植的分化細胞來自成年小鼠的胃細胞，其體內沒有出現腫瘤。上述研究表明選擇何種體細胞作為培育 iPS 細胞的原料是非常重要的。

總之，iPS 細胞應用于臨床之前，其安全性需要進一步的評價和提高，雖然很多研究都在這方面努力，但是徹底解決 iPS 細胞的安全性問題尚需時日。

2 iPS 細胞的應用性

成功建立 iPS 細胞后，應用 iPS 細胞來治療疾病是人們的最終目標。iPS細胞不僅可用于分化和移植，還可以提供體外的疾病模型，以便于研究疾病形成的機制、篩選新藥以及開發新的治療方法。

⑴iPS 細胞的分化和移植在治療血液疾病中顯示了很大的用途。Xu 等[25]將 iPS 細胞誘導分化為內皮前體細胞，然后移植到患有血友病小鼠的肝臟中，使病鼠出血不止的癥狀得到了有效地改善。Hanna 等[26]將患病小鼠尾尖成纖維細胞重編程為 iPS 細胞，然后通過同源重組的方法用人野生型 βA-珠蛋白基因替代了 βS-珠蛋白基因，接著把遺傳修飾后的 iPS 細胞定向分化為造血祖細胞（HPs），并將純化后的 HPs 移植入 hβS/hβS 雄性小鼠中，HPs 有效地抑制了鐮刀形紅細胞貧血癥癥狀。Raya 等[27]獲得了基因修飾后的貧血癥患者特異性iPS 細胞，這些 iPS 細胞能夠分化形成表型正常的髓系和紅系的造血祖細胞。中內啟光等研究人員在培養 iPS 細胞時，添加人類骨髓細胞以及促進細胞增殖的蛋白質等物質，結果 iPS 細胞分化成了血小板的前身巨核細胞，巨核細胞進一步分化成血小板。從技術上來說，用 iPS 細胞培育人類紅細胞和白細胞都是可能的[28]。紅細胞體外培育的成功為人類研究通用紅細胞提供了新的契機。筆者所在研究組正在努力用一 O 型 Rh 陰性個體體細胞重編程為 iPS 細胞，進而對該 iPS 細胞進行體外定向誘導分化，培育出通用紅細胞。Lu 等[29]已建立了一個從人 ES 細胞高效地分化成紅細胞的系統。如果將該系統應用于患者特異性 iPS 細胞上，就可獲得無限量的患者自身的紅細胞，這對于治療一些血液疾病以及為罕見血型患者提供血細胞有著重要意義。

⑵iPS 細胞還可治療神經系統疾病。Wernig 等[30]將 iPS 細胞分化為神經前體細胞，然后把這些細胞移植入胎鼠腦中，它們可整合到受體鼠的腦中，13.5 d 后形成神經膠質細胞和神經元細胞，包括谷氨酰胺能神經元、GABA 能神經元、兒茶酚胺能神經元細胞。將由小鼠 iPS 細胞在體外誘導分化來的多巴胺能神經元移植進帕金森病大鼠模型腦內，一段時間后可有效緩解大鼠疾病癥狀和改善其行為。最近，利用帕金森癥患者的皮膚細胞培育出iPS 細胞后，又成功將其分化為多巴胺神經元細胞，這是帕金森癥患者大腦中所缺少的一種重要細胞[31]。因此，其有望成為治療帕金森癥的一種方法。

⑶iPS 細胞也有望應用于治療不孕癥。Park 等[32]將人 iPS 細胞體外分化并分離得到原始生殖細胞（PGCs）。PGCs 在基因表達上與體內分離的 PGCs 極為相似。如果能夠進一步將這些 PGCs 分化為精子和卵子，就可幫助患者解決不孕問題。

⑷來源于耳蝸毛細胞的iPS 細胞成功用于治療神經感覺性聽力障礙[33]。iPS 細胞在體外還成功定向分化了多種細胞，例如胰腺細胞和肝細胞[34]、分泌胰島素的 β 細胞[35]、血管內皮細胞、淋巴內皮細胞和心肌細胞[36]。

⑸提供體外的疾病模型，以便于研究疾病形成的機制、篩選新藥以及開發新的治療方法。Dimos 等[37]和Ebert等[38]分別建立了肌萎縮側索硬化癥（ALS）和脊髓性肌萎縮（SMA）患者特異性 iPS 細胞。通過定向誘導分化，將患者特異性的 iPS 細胞成功分化成了運動神經元。這些由患者來源的 iPS 細胞分化等的運動神經元為人們提供了一個體外研究 ALS 和 SMA 疾病的系統。在研究清楚了 ALS 和 SMA患者運動神經元的致病機制后，還可在患者特異的 iPS 細胞中通過遺傳修飾來糾正基因缺陷，再分化得到功能正常的運動神經元，以進行移植治療。此外，Park 等[39]和 Soldner等[14]建立了多種遺傳病患者特異性的 iPS 細胞系，包括帕金森病、亨廷頓病、唐氏綜合征/三染色體 21 等。Loh 等[40]成功地以人血液細胞為體細胞供體，誘導出了 iPS 細胞，使得構建一些病癥突變只局限于血液細胞的患者特異性 iPS 細胞成為可能。利用從罕見神經系統疾病患者身上產生的干細胞，科學家們正在解析該種疾病的發病機制，并以此來測試若干候選藥物的療效[41]。從家族性植物神經功能不全癥（FD，有一個基因突變，該基因對 IKAP 的蛋白進行編碼，基因突變導致基因被轉譯成蛋白時部分基因序列被跳過）患者身上獲取皮膚細胞，創建出 iPS 細胞系，誘導為特定的細胞類型，如神經嵴細胞（它能產生受 FD 影響的神經元）。這些細胞在分化成神經元的能力上是具有缺陷的，其并不像培養皿中的正常細胞一樣容易遷移。研究人員利用此種差異來衡量 3 種藥物的療效，這幾種藥已被提議作為治療 FD 的候選藥物，其中一種藥物就是激動素[41]。

這些患者特異性 iPS 細胞令體外研究病變的人體組織的形成成為可能，從而有助于探索疾病形成機制以及研發特異性新藥。這些研究成果還表明將來有可能為患者量身定做各種細胞，進行個性化治療。但是由于對干細胞（包括 iPS 細胞、ES 細胞和成體干細胞）自我更新與分化等行為的調控機制知之甚少，目前人們還不能按照自己的意圖將干細胞在體外定向誘導分化為所需要的任何的功能細胞。隨著人類對干細胞分化調控機制認識的不斷加深，從人 iPS 細胞將會衍生出更多種類的人類細胞，將為細胞替代治療新藥篩選與評價及其他用途提供大量的細胞。

3 小結與展望

由于 iPS 細胞自身的安全性問題，目前 iPS細胞還無法應用于臨床治療。要得到安全實用的有臨床應用價值的治療型 iPS 細胞，我們必須避免使用整合性病毒以及有致癌性的外源基因。根據 iPS 細胞在短時間內取得的一系列突破，可以預見，iPS 細胞必將解決人類面臨的各種疾患。目前，還面臨許多急待突破的瓶頸和需要深入研究的領域：①研究 iPS 細胞自我復制、增殖和分化等的調控機制及 iPS 細胞體外定向誘導分化機制；②充分評價 iPS 細胞臨床應用的安全性；③建立無遺傳修飾的 iPS 細胞制備方法（如僅利用蛋白或小分子化合物即將人的細胞重編程為 iPS 細胞）。

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安群星，Email：bestar@fmmu.edu.cn

2009-12-29

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.013