溫度和pH對重組人血管內皮抑制素脫酰胺的影響

解茹，張貴鋒，高建萍，王明林，馬潤宇，蘇志國

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溫度和pH對重組人血管內皮抑制素脫酰胺的影響

解茹，張貴鋒，高建萍，王明林，馬潤宇，蘇志國

100029 北京化工大學生命科學與技術學院（解茹、馬潤宇）；100190 北京，中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室（張貴鋒、蘇志國）；271018 泰安，山東農業大學食品學院（高建萍、王明林）

利用液質聯用技術研究溫度和 pH 對重組人血管內皮抑制素中天冬酰胺（Asn）脫酰胺過程的影響。

在不同的溫度和 pH 值條件下，對重組人血管內皮抑制素樣品溶液進行孵化，酶解處理后利用液質聯用技術識別發生脫酰胺的多肽并測定其含量隨樣品放置溫度和 pH 條件的變化。

質譜分析結果表明酶解產物中多肽 SVWHGSDPNGR序列中的 Asn 發生了脫酰胺化，Asn 殘基生成了天冬氨酸和異天冬氨酸殘基，其他位置的 Asn 均未檢測出明顯的脫酰胺化；實驗獲得了不同溫度和 pH 條件下重組人血管內皮抑制素中 Asn 脫酰胺化的速率及動力學常數；Asn 脫酰胺過程隨著溫度和溶液pH 值的升高，Asn 脫酰胺速率上升。

重組人血管內皮抑制素中天冬酰胺的脫酰胺過程受儲存溫度和 pH 值影響，研究藥用蛋白質在不同條件下的脫酰胺過程對于篩選合適的儲存條件、減少活性損失具有重要意義。

血管抑制素類； 天冬酰胺； 肽類；色譜法，高壓液相

蛋白質中 Asn 或 Gln 殘基均可發生非酶催化的脫酰胺化，但 Gln 的脫酰胺速率遠低于 Asn[9]。Asn 的脫酰胺包括兩步反應，先形成五元環的琥珀酰亞胺，再發生環內酰胺鍵水解（圖 1）。環內酰胺鍵斷裂可發生在琥珀酰亞胺的任何一端并形成天冬氨酸（Asp）和異天冬氨酸（isoAsp），但最終蛋白中的脫酰胺產物多為 Asp，其可能是 Asp 作為天然氨基酸更能穩定存在于蛋白質結構中[10]，Asn 的脫酰胺速率受蛋白質的氨基酸序列及三維結構、儲存溫度和pH值、離子種類和離子強度等因素影響[9-11]。在脫酰胺位點識別方面，離子交換色譜因分離含 Asp 與 IsoAsp 多肽存在一定難度導致其用于脫酰胺化研究存在局限性[12]。羧酸甲基轉移酶法分析 Asn 脫酰胺位點具有特征性強等優點，但檢測過程繁瑣且需要使用難以獲得的工具酶，導致該方法應用并不十分廣泛[13]。反相色譜具有分辨率高和穩定性好等優點，盡管使用反相色譜可區分發生脫酰胺前后的多肽，但多肽的分離度對結果影響較大[14]，而高效液相色譜質譜聯用技術可通過色譜分離脫酰胺前后的多肽，利用質譜技術識別脫酰胺化位置等優點，在脫酰胺化研究中的應用日益增多[6, 8]。

Asn、Asu、Asp、isoAsp 理論分子量按單一同位素計算

Figure 1 The mechanism of asparagine deamidation and aspartic acid isomerization via succinimide intermediate

重組人血管內皮抑制素（rhEndostatin）是一種在大腸桿菌中表達用于治療腫瘤的蛋白質藥物，與人 XVIII 膠原蛋白的羧基末端具有同源性[15]。rhEndostatin 具有特異性抑制腫瘤血管內皮細胞增殖功能，從而起到抗腫瘤作用[16]。本研究以重組人血管內皮抑制素為模型蛋白，利用高效液相色譜質譜聯用技術研究了不同放置條件下天冬酰胺殘基的變化，探索其脫酰胺化的規律，為蛋白質藥物儲存過程中的穩定性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 重組人血管內皮抑制素（批號 20070303）為煙臺麥得津生物工程股份有限公司產品；胰蛋白酶（序列純）購自美國 Promega 公司；二硫蘇糖醇（DTT）購自美國 Sigma 試劑公司；三氟乙酸（TFA）和乙腈為美國 Merck 公司產品；其他試劑均為市售分析純。

1.1.2 儀器設備 液相色譜質譜聯用系統由美國安捷倫公司的 Agilent 1100 HPLC 和 Thermo Fisher公司的 LCQ DecaXP電噴霧質譜組成，數據采集軟件和多肽質譜數據處理軟件分別為 Xcalibur 1.3 和Bioworks 3.1。

1.2 方法

1.2.1 rhEndostatin 樣品處理 將重組人血管內皮抑制素樣品溶于不同 pH 的 Tris-HCl 溶液（0.1 mol/L，pH 3.0、4.0、5.0），濃度控制在1 mg/ml；將各樣品溶液放置在 70 ℃條件恒溫處理，每 24 h 取樣 200 μl；使用 pH 10.0 的 Tris-HCl緩沖液將提取的每個樣品的 pH 調至 8.0，加入胰蛋白酶（1mg/ml，0.05 mol/L NH4HCO3，pH 8.0），加入比例為 50:1（蛋白質：酶），37 ℃放置 6 h 后加入 5 μl DTT（0.4 mol/L，0.05 mol/L NH4HCO3），混合均勻后于 37 ℃恒溫反應 30 min 以打開全部二硫鍵，將該多肽混合物于–20 ℃放置。

利用上述方法將重組人血管內皮抑制素溶液分別在 37 和 50 ℃條件下放置，研究溫度對脫酰胺過程的影響。不同 pH 條件下的樣品按照相同的方法將實驗重復兩次。實驗利用同一樣品不同濃度條件下通過脫酰胺化和未發生脫酰胺化多肽的峰面積考察方法的穩定性。

1.2.2 高效液相色譜質譜設置參數 色譜柱：Agilent SB C18(150 mm × 2.1 mm，5 μm)；流動相 A：水（含 0.3% TFA），B：乙腈（含 0.3% TFA）；梯度：0 ~ 120 min，0 ~ 40% B，120 ~ 150 min，40% ~ 100% B；流速：0.2 ml/min，進樣量 20 μl。離子源（ESI）噴霧電壓 4.5 kV；毛細管溫度300 ℃；鞘氣（N2）60 個單位（約 400 kPa）；一級質譜掃描范圍m/z330 ~ 2000；精確質量數掃描（zoomscan）和二級質譜（MS/MS）掃描均為數據依賴型掃描（data dependent scan），動態排除次數 1；動態排除時間 0.5 min；二級質譜碰撞能量為 35%。

1.3 數據處理

將實驗得到的質譜數據使用 Bioworks 3.1 軟件進行處理，數據檢索過程重點檢測含天冬酰胺的多肽，當檢測出的多肽與其理論質荷比（m/z）之差為1 時，通過二級質譜確認該多肽中 Asn 是否發生了脫酰胺。

2 結果

2.1 脫酰胺化位點識別

重組人血管內皮抑制素共含有 184 個氨基酸，有4 個 Asn，通過質譜數據庫檢索分析并結合各色譜峰中的多肽識別結果表明含Asn 的多肽均能實現完全分離（圖 2），同時發現僅多肽SVWHGSDPNGR（m/z 1211.7）中的Asn 發生了脫酰胺化。

將重組人血管內皮抑制素在一定的 pH 和溫度條件下進行脫酰胺加速實驗，Asn 在非酶催化條件下發生的脫酰胺化一般經過琥珀酰亞胺中間產物再形成 isoAsp 和 Asp。圖 3 為重組人血管內皮抑制素在 pH 5.0、70 ℃放置不同時間后其酶解產物中 m/z 1211.7 和 1212.7 的提取離子流圖，色譜峰P2 和 P3 對應的多肽VWHGSDPN*GR 中第 8 位氨基酸應分別為 isoAsp 和 Asp，兩者比例約為 2:1[3]。

相對豐度Relative abundance 時間（min） Time (min)

Figure 2 Total ion current chromatogram of the tryptic digest of rhEndostatin

相對豐度Relative abundance 時間（min） Time (min)

Figure 3 Extracted ion chromatograms for m/z 1211.7 and 1212.7 of the tryptic digest of rhEndostatin

Asn 發生脫酰胺化后形成Asp（或isoAsp），質量數增加 1 Da。以圖 3C 為例，保留時間為 50.34 min 的色譜峰中檢測出帶單電荷的離子 m/z 1211.7 和帶雙電荷的離子 m/z 606.4（圖 4A），其二級質譜表明離子 m/z 1211.7 和 m/z 606.4 來自多肽SVWHGSDPNGR（圖 4C）；保留時間為 50.95 和 52.70 min 的色譜峰中均檢測出帶單電荷的離子 m/z 1212.7 和帶雙電荷的離子 m/z 606.9（圖 4B），二級質譜表明離子 m/z 1212.7 和 m/z 606.9 來自多肽 VWHGSDPDGR（圖 4D），表明多肽 VWHGSDPNGR 中的天冬酰胺發生了脫酰胺化。多肽序列中 Asn 殘基的脫酰胺化將導致多肽親/疏水性發生變化，本研究為有效分離發生脫酰胺化和未發生脫酰胺化的多肽，實驗中降低了色譜流動相的梯度。

2.2 pH 對脫酰胺過程的影響

通過測定重組人血管內皮抑制素在70 ℃、不同 pH 條件下放置后其酶解產物中多肽 VWHGSDPGR 和 VWHGSDPGR 的相對含量，以便計算出在相同溫度，不同 pH 條件下 VWHGSDPGR 發生脫酰胺的比例。在放置初期重組人血管內皮抑制素中 Asn127的脫酰胺化的比例隨時間延長逐漸增加（圖 5），4 d 后脫酰胺化多肽的相對含量變化趨于穩定。在方法的穩定性實驗中，利用同一樣品研究了不同濃度溶液通過積分脫酰胺化和未發生脫酰胺化多肽的峰面積以考察方法的穩定性，結果表明方法的日內穩定性和日間穩定性的 RSD 均低于 2.8%。

圖 4 提取離子流圖 3C 中保留時間為 50.34、50.95 min 多肽的譜圖（A、B：質譜圖；C、D：二級質譜圖）

Figure 4 Spectra of peptide contained in the chromatgraphic peaks with retention time 50.34 and 50.95 min in Figure 3C (A, B: Mass spectra; C, D: MS/MS spectra)

圖 5 不同 pH 條件下發生脫酰胺重組人血管內皮抑制素的百分含量

Figure 5 The deamidation percentage of rhEndostatin incubated at different pH

研究表明在一定溫度條件下非酶催化的脫酰胺過程為一級反應[17]，在不考慮逆反應的條件下，脫酰胺過程的反應速率與未發生脫酰胺蛋白的濃度呈比例，脫酰胺化蛋白濃度可用如下方程表示：

P=P（－-kt），P=Pe-kt。其中，P表示未發生脫酰胺化的蛋白濃度；P表示發生脫酰胺的蛋白濃度；P表示總蛋白濃度；表示脫酰胺反應的速率常數。

本研究測定了不同pH 條件下重組人血管內皮抑制素脫酰胺的速率，如圖6 所示。計算表明在70 ℃、pH 分別為 3.0、4.0、5.0 條件下重組人血管內皮抑制素的脫酰胺速率常數分別為1= 0.29 d-1、2= 0.38 d-1、3= 0.45 d-1。

2.3 溫度對脫酰胺過程的影響

本研究確定了重組人血管內皮抑制素在相同pH、不同溫度條件下放置過程中脫酰胺隨時間的變化趨勢。圖 7 是在 pH 5.0，溫度分別為 37、50 和 70 ℃條件下不同放置時間重組人血管內皮抑制素中 Asn127發生脫酰胺化的變化趨勢。由圖 7 可見脫酰胺速率隨溫度升高而逐漸加快。

圖 6 不同 pH 條件下重組人血管內皮抑制素脫酰胺反應速率常數

Fgiure 6 The kinetic constant of deamidation process of the rhEndostatin incubated at different pH

圖 7 pH 5.0，不同溫度重組人血管內皮抑制素脫酰胺含量變化

Figure 7 The deamidation percentage of rhEndostatin incubated at pH 5.0 and different temperature

本研究測定了上述條件下Asn127脫酰胺化的速率常數（圖 8）。結果表明在 37、50、70 ℃三個溫度下的脫酰胺速率常數分別為1= 0.0093 d-1、2= 0.068 d-1、3= 0.38 d-1。

圖 8 pH 5.0，不同溫度重組人血管內皮抑制素脫酰胺反應的速率常數

Figure 8 The kinetic constant of deamidation process of the rhEndostatin incubated at pH 5.0 and different temperature

3 討論

在脫酰胺位點識別方面，本研究僅檢測到多肽SVWHGSDPNGR（m/z 1211.7）中的 Asn 發生了脫酰胺，其他位置的 Asn 未檢測到明顯的脫酰胺化，說明 Asn 羧基端的氨基酸對其脫酰胺速率影響較大，當與 Asn 羧基相連的氨基酸為 Gly 時，Asn 非常容易發生脫酰胺化，可能原因是與 Asn 羧基相連的氨基酸側鏈越長，則空間位阻越大，Asn 側鏈的 N 難以被接近導致脫酰胺不易發生，溶劑能進入 Asn 的側鏈區域和Asn 所在的局部結構具有靈活可變性是 Asn 發生脫酰胺化的重要條件。因此，蛋白質的高級結構對 Asn 的脫酰胺速率有一定影響[11]。同時，當 Asn 后面的氨基酸為極性且側鏈較短時，如 Ser、The 和 Asp，脫酰胺難度相對有所增加；當 Asn 后面的氨基酸為疏水性且側鏈較長時，Asn 發生脫酰胺化的難度更大。

在 pH 值對脫酰胺速率影響方面，Vlasak 等[18]研究了人 IgG1 抗體輕鏈 CDR1 中 Asn 脫酰胺隨 pH 的變化，表明在 pH 4.0 ~ 7.0 范圍內，Asn 脫酰胺速率也呈隨 pH 升高而增加的趨勢。由本實驗測定脫酰胺速率常數發現，在相同溫度條件下，pH 3.0 ~ 5.0 范圍內脫酰胺速率隨著 pH 值的上升而增加，其可能原因是脫酰胺化過程是一親核反應，堿性條件下親核反應更容易進行，故隨著 pH 升高酸性逐漸減弱，堿性逐漸增強，導致反應速率常數在一定范圍內逐漸增加。

在溫度對脫酰胺速率的影響方面，通過研究發現，在相同的 pH 條件下，隨著溫度的升高天冬酰胺脫酰胺反應速率逐漸增大。在不考慮溫度對蛋白質結構的影響條件下，反應速率常數與溫度之間的關系應符合阿累尼烏斯方程，但根據實驗結果計算出的速率常數與溫度之間的關系并不完全符合阿累尼烏斯方程，其可能原因是溫度升高對蛋白質的結構產生了一定影響，使得重組人血管內皮抑制素疏水性的結構發生聚集，而親水性的結構域暴露在蛋白質外部，導致脫酰胺化過程加快。因此，溫度變化導致的蛋白質結構變化對脫酰胺過程存在一定影響。

重組人血管內皮抑制素中天冬酰胺的脫酰胺過程受其氨基酸序列、儲存溫度和 pH 值影響，且在一定條件下隨著溫度和 pH 值的升高，脫酰胺速率逐漸加快。脫酰胺化是藥物蛋白存放過程中化學降解和活性降低的重要原因之一[19]，研究藥用蛋白質在不同條件下的脫酰胺過程對于篩選合適的儲存條件、減少活性損失具有參考價值。

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Effect of temperature and pH on the deamidation process of Asn in rhEndostain

XIE Ru, ZHANG Gui-feng, GAO Jian-ping, WANG Ming-lin,MA Run-yu, SU Zhi-guo

Author Affiliations: College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China (XIE Ru, MA Run-yu); State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China (ZHANG Gui-feng, SU Zhi-guo); College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China (GAO Jian-ping, WANG Ming-lin)

To investigate the effect of temperature and pH on the deamidation process of asparaginyl (Asn) in the rhEndostatin using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

The samples of rhEndostatin were incubated at different temperature and pH, and then digested by trypsin. The peptides in the digest mixture were analyzed to identify the deamidation site of Asn. The ratio of deamidation of sample inculated at different temperature and pH was determined.

The Asn in the peptide, SVWHGSDPNGR, was found to deamidate and transform into asparate (Asp) and isoaspartate (isoAsp). No obvious deamidation in Asn except in the SVWHGSDPNGR was observed. The effect of incubation temperature and pH on the deamidation process and kinetic constant was investigated. The kinetic constant of Asn deamidation is accelerating with the increasing of temperature and the pH of solution.

The deamidation process of Asn in rhEndostatin is affected by the pH of solution and the temperature of storage. Thus, studying of the deamidation of pharmaceutical proteins in different conditions is important for selecting proper storage environment and reducing the loss of activity.

Angiostatins; Asparagine; Peptides; Chromatography, high pressure liquid

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.002

國家高技術研究發展計劃（863 計劃）（2007AA021604）

張貴鋒，Email：gfzhang@home.ipe.ac.cn

2009-11-16

ZHANG Gui-feng, Email: gfzhang@home.ipe.ac.cn

中國醫藥生物技術