10-羥基喜樹堿的提取方法及工藝優化研究

趙榮國，真國輝，王賀雙

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10-羥基喜樹堿的提取方法及工藝優化研究

趙榮國，真國輝，王賀雙

116023 大連國人生物科技有限公司（趙榮國、真國輝）；116024 大連理工大學環境與生命學院（王賀雙）

10-羥基喜樹堿是從我國特有植物喜樹（）中分離得到的 20 多個單體中抗腫瘤作用最強的生物堿，它不僅是臨床效果較好的抗腫瘤藥物，而且還是制備其他喜樹堿類衍生物藥品的重要中間體。由于喜樹中 10-羥基喜樹堿含量甚微，其制備方法的研究已成為當前熱點，其中利用現代生物工程技術的方法尤為引人注目[1]。但至今鮮有報道從喜樹細胞培養物中提取天然 10-羥基喜樹堿的生產工藝[2-5]，本文就經次生代謝調控和微生物轉化后的喜樹細胞培養物中提取天然 10-羥基喜樹堿的方法及工藝進行了研究，以期為規?；a提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 試劑 甲醇、乙醇，分析純，購自天津東麗化學試劑廠；二氯甲烷，分析純，購自天津瑞金化學試劑廠；氫氧化鈉、石油醚、環己烷，分析純，購自北京化工廠；10-羥基喜樹堿標準品由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.1.2 儀器 高效液相色譜儀為美國 Waters 公司產品；Techsphere ODS 色譜柱和 KQ2250DB 超聲波清洗儀均為大連依利特分析儀器有限公司產品；RS-20III冰凍高速離心機為日本Tokyo 公司產品；H.H.S21.6 恒溫水浴鍋為上海醫療器械五廠產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養物樣品 將收獲的細胞培養物于 60℃烘箱中烘干后粉碎，過 60 目篩備用。

1.2.2 乙醇回流提取 稱取細胞培養物樣品 10 g，按表 1 設計因素水平，選 L9（34）正交設計表，進行乙醇回流提取，收集提取液，濃縮后進行測定。

表 1 試驗因素水平表

1.2.3 堿水回流提取 稱取細胞培養物樣品 10 g，按表 2 設計因素水平，選 L9（34）正交設計表，加稀 NaOH 溶液回流提取，收集提取液，適當濃縮，調 pH 至 6.0 左右，離心半徑 9 cm，8 000 r/min 離心10 min，沉淀用適量甲醇溶解后進行測定。

1.2.4 乙醇超聲提取 稱取細胞培養物樣品 10 g，在 25 ℃，工作頻率為 40 kW 的條件下，分別以 15、20 倍量的 75%乙醇超聲提取 30 和 60 min，見表 3。

表 2 試驗因素水平表

表 3 超聲提取試驗表

1.3 含量測定

1.3.1 高效液相色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水（60:40）為流動相；流速 1.0 ml/min；柱溫 25 ℃；檢測波長為 266 nm；出峰時間約 24 min。

1.3.2 樣品測定 按照 10-羥基喜樹堿標準品的測定條件，分別測定乙醇回流提取樣品、堿水回流提取樣品以及超聲提取樣品中 10-羥基喜樹堿的含量。

2 結果

2.1 標準曲線的制備

取0.02 mg/ml 的 10-羥基喜樹堿標準液，稀釋成 0.8 × 10-3~ 12 × 10-3mg/ml 的系列溶液，進樣 20 μl，以濃度與峰面積進行線性回歸，得標準曲線方程：Y = 68.552X+32.138，= 0.9995。10-羥基喜樹堿在 0.8 × 10-3~ 12 × 10-3mg/ml 時濃度與峰面積具有良好的線性關系。

2.2 乙醇回流提取工藝的正交試驗

根據極差 R 的大小，其影響順序為 A > D > B > C，即乙醇濃度 > 提取次數 > 提取時間 > 溶劑量，最佳工藝為 A1B3C3D3，即 20 倍 75% 乙醇回流提取 3 次，1.5 h/次，結果見表 4。

2.3 堿水回流提取工藝的正交試驗

根據極差 R 的大小，其影響順序為 A > D > B > C，即堿的濃度 > 提取次數 > 提取時間 > 溶劑量，最佳工藝為 A2B1C2D3，即 15 倍 0.3% NaOH 溶液回流提取 3 次，0.5 h/次，結果見表 5。

表 4 乙醇回流提取正交試驗安排及結果

表 5 堿水回流提取正交試驗安排及結果

2.4 乙醇超聲提取

由表 6 可以看出，與乙醇回流提取最佳工藝相比，乙醇超聲提取 10-羥基喜樹堿的得率更高。

3 討論

通過考察不同的提取方法對 10-羥基喜樹堿提取的影響，結果表明：乙醇回流提取時以75% 乙醇作溶劑效果較好，可能是高濃度乙醇不易穿透脫分化組織的細胞壁；堿水回流提取的效果較差，可能是 10-羥基喜樹堿 E 環的 α-羥基內酯結構遇堿開環生成鈉鹽后，再遇酸不能完全還原為 10-羥基喜樹堿的緣故；以 75% 乙醇作溶劑進行超聲提取，有利于喜樹細胞培養物中 10-羥基喜樹堿的提取，收率高且工藝簡單。由于超聲波可以使液體流動，并產生空化現象，從而有利于將 10-羥基喜樹堿從喜樹脫分化組織中快速地浸提出來。喜樹細胞培養物中 10-羥基喜樹堿提取的最佳工藝為 20 倍量的 75% 乙醇超聲提取 60 min。

表 6 乙醇超聲提取結果

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大連市產業技術創新資金項目（2008039）

2009-09-25

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.014

趙榮國，Email：zrgmail@sina.com