多藥耐藥相關(guān)蛋白-3表達(dá)與肝癌耐藥的相關(guān)性

郭曉林 姜雅秋 金清龍

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130021)

腫瘤細(xì)胞多藥耐藥產(chǎn)生的分子機(jī)制非常復(fù)雜,在所有耐藥機(jī)制中,被認(rèn)為是最主要的也是人們研究最多就是 ABC結(jié)合核膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,如P-糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白 1(MRP-1)及乳腺癌耐藥蛋白;而最近又發(fā)現(xiàn)幾個(gè)多藥耐藥相關(guān)蛋白的新成員-多藥耐藥相關(guān)蛋白-2(MRP-2)、MRP-3、MRP-5〔1～4〕,為探討MRP-3與肝癌耐藥的相關(guān)性,我們從分子水平研究MRP-3在肝癌耐藥細(xì)胞株 HepG2/ADM與肝癌細(xì)胞株和正常肝細(xì)胞株中的差異表達(dá)情況,為肝癌的多藥耐藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及來(lái)源 人肝臟細(xì)胞系 L-02和肝癌細(xì)胞系 BEL購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。人肝癌耐藥細(xì)胞Hep G2/ADM購(gòu)于廣州市達(dá)暉生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑、材料與儀器 阿霉素標(biāo)準(zhǔn)品、MTT均購(gòu)自Sigma公司,RNA提取試劑盒、Trizol試劑及逆轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV均為為 Invitrogen產(chǎn)品;DNA聚合酶為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品;顯色試劑盒ECL Western印跡試劑為 Amersham產(chǎn)品。Microplate Reader450酶標(biāo)儀;GeneAmp PCR System 2400型 PCR擴(kuò)增儀;EPICS型流式細(xì)胞儀;AlphaEaseFC凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 RT-PCR法檢測(cè) MRP3mRNA的表達(dá) 采用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA,M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增,合成 cDNA。以 β-actin作為內(nèi)參照。PCR引物序列為 MRP3(107 bp):上游 5′-CTTAAGACTTCCCCTCAACATGC-3′,下游 5′-GGTCAAGTTCCTCTTGGCTCA-3′;β-actin(214 bp):上游 5′GTGGGGCGC CCCAGACACCA 3′, 下 游 5′CTCCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′;擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性 5min,94℃30s,55℃30 s,72℃1 min,25個(gè)循環(huán),72℃延伸 7 min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,在多向分析凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

1.4 MRP-3寡核苷酸的轉(zhuǎn)染 參照脂質(zhì)體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。HepG2/ADM細(xì)胞消化后計(jì)數(shù),分別接種于 6孔細(xì)胞貼壁,更換無(wú)血清培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分反義組、正義組、空脂質(zhì)體組及對(duì)照組。每組設(shè) 3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。具體步驟按說(shuō)明書(shū)操作。全硫代磷酸修飾的正、反義寡核苷酸(22 bp):MRP-3正義鏈:5′-GATCCGAGTAAGACCATTCAGGTCTTCAAGAGAGAGACCTGAAT GGTCTTACTCTTTTTTA-3′;反 義 鏈:5′-AGCTTAAAAAAGAGTAAGACCATTCAGGTCTCTCTTGAAGACCTGAATGGTCTTACTCG-3′。

1.5 胞內(nèi) ADM濃度的測(cè)定 取轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染 24 h后Hep G2/ADM細(xì)胞,胰酶消化,調(diào)整細(xì)胞密度為 5×105/ml,細(xì)胞貼壁后加入 ADM 1μmol/L,37℃作用 30 min,冷 PBS洗 1次,更換無(wú)藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 30 min后收獲細(xì)胞,采用 FCM檢測(cè)胞內(nèi) ADM的熒光強(qiáng)度。

1.6 轉(zhuǎn)染后MRP-3 mRNA的表達(dá) 半定量RT-PCR法測(cè)定。收集 6孔板中轉(zhuǎn)染 24h的各組細(xì)胞,行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后在多向分析凝膠成像系統(tǒng)中掃描并分析、計(jì)算 MRP-3基因的相對(duì)表達(dá)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.7 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)ADM耐藥指數(shù) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 24 h后,在96孔板中分別加入 6個(gè)不同濃度的 ADM,設(shè) 5個(gè)復(fù)孔,對(duì)照組加生理鹽水,繼續(xù)培養(yǎng) 48 h,吸出培養(yǎng)基,每孔加入 5 mg/ml MTT 10μl,37℃ 4 h。每孔加入 200μl二甲亞砜,避光振蕩混勻,全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定 620nm波長(zhǎng)的吸光度值(A),細(xì)胞相對(duì)存活率 =(實(shí)驗(yàn)組 A/對(duì)照組 A)×100%,作圖得 IC50,計(jì)算耐藥指數(shù)(RI),RI=耐藥細(xì)胞 IC50/親代細(xì)胞 IC50。

2 結(jié) 果

2.1 MRP-3 mRNA在各細(xì)胞系中的表達(dá) MRP-3mRNA在L-02中表達(dá)量為 4 620±362,在 BEL中表達(dá)量為 7 871±386,此兩組 MRP-3mRNA表達(dá)量明顯低于 HepG2/ADM中的表達(dá)量(9 802±373)(P均 ＜0.05)。

2.2 Hep G2/ADM細(xì)胞內(nèi) ADM熒光強(qiáng)度檢測(cè) 轉(zhuǎn)染前Hep G2/ADM細(xì)胞內(nèi) ADM的熒光強(qiáng)度為 6.94±0.57,單純轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體及正義鏈后,其內(nèi) ADM的熒光強(qiáng)度分別為 6.25±0.55和 6.59±0.45,較轉(zhuǎn)染前無(wú)明顯改變(P＞0.05)。轉(zhuǎn)染反義鏈后,其內(nèi)ADM的熒光強(qiáng)度分別為 9.68±0.58,較轉(zhuǎn)染前明顯增加(P＜0.05)。

2.3 轉(zhuǎn)染前后 HepG2/ADM細(xì)胞 ADM耐藥指數(shù) 轉(zhuǎn)染前Hep G2/ADM細(xì)胞的ADM耐藥指數(shù)為 18.56,轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體和正義鏈的 HepG2/ADM細(xì)胞的 ADM耐藥指數(shù)分別為 17.78和16.89,與轉(zhuǎn)染前的耐藥指數(shù)無(wú)明顯差異,而轉(zhuǎn)染反義鏈的Hep G2/ADM細(xì)胞ADM耐藥指數(shù)為 5.56,較轉(zhuǎn)染前明顯下降(P＜0.05)。

2.4 轉(zhuǎn)染前后Hep G2/ADM細(xì)胞MRP-3 mRNA的表達(dá) 單純轉(zhuǎn)染空脂質(zhì)體及正義鏈的 HepG2/ADM細(xì)胞 MRP-3 mRNA的表達(dá)分別為 89.67±4.28和 85.34±4.56,與轉(zhuǎn)染前(86.87±4.67)無(wú)明顯降低,而轉(zhuǎn)染反義鏈后,HepG2/ADM細(xì)胞MRP-3 mRNA的表達(dá)(32.58±3.75)較轉(zhuǎn)染前明顯降低了 62.5%(P＜0.05)。

3 討 論

腫瘤耐藥的本質(zhì)是腫瘤細(xì)胞在生存壓力下建立起來(lái)的一種適應(yīng)過(guò)程,其產(chǎn)生和維持有其復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)。因此,從基因表達(dá)水平尋找在耐藥產(chǎn)生中具有關(guān)鍵作用的分子改變,對(duì)于全面了解耐藥機(jī)制從而逆轉(zhuǎn)耐藥具有重要的意義。MRP-3是多藥耐藥蛋白家族的成員之一,屬 ATP膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在氨基酸序列上與 MRP-1有 58%同源性,編碼分子量為 190 kD的糖蛋白,在肝、十二指腸、結(jié)腸、腎上腺及胰腺中呈高表達(dá)。作為胞漿膜流出泵,在VP16的流出、活性及敏感性方面起關(guān)鍵作用,參與了 VP16、MTX、DDP、DOX的耐藥,而反義 MRP-3 cDNA能改變 VP16、DDP等藥物的敏感性〔5～7〕。

本研究采用 RT-PCR方法檢測(cè)了正常肝細(xì)胞,肝癌細(xì)胞及肝癌耐藥細(xì)胞中MRP-3的表達(dá)情況,結(jié)果表明肝癌耐藥細(xì)胞中的MRP-3 mRNA的表達(dá)量明顯高于正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞。故此我們推測(cè) MRP-3可能參與了肝癌的耐藥,這與 Leah等〔8〕報(bào)道的MRP-3參與非小細(xì)胞肺癌的耐藥機(jī)制具有一定的相似性。

反義治療是基因治療的重要組成部分,其阻斷作用主要在翻譯過(guò)程,而翻譯起始位點(diǎn)附近的核苷酸常常是決定翻譯的關(guān)鍵因子,因此與mRNA起始編碼區(qū)的結(jié)合可能起最有效的阻斷作用。根據(jù)這一原則及 MRP-3 cDNA序列,設(shè)計(jì)并人工合成了包含 MRP-3 mRNA翻譯起始位點(diǎn) ATG的寡脫氧核苷酸,通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體載體,將 MRP-3片段轉(zhuǎn)染進(jìn)高表達(dá) MRP3的Hep G2/ADM細(xì)胞后,MRP-3mRNA表達(dá)顯著下降,胞內(nèi)藥物濃度顯著上升,對(duì)阿霉素的敏感性得到恢復(fù);而轉(zhuǎn)染正義寡核苷酸或脂質(zhì)體的耐藥株上述指標(biāo)無(wú)顯著變化。進(jìn)一步證實(shí)肝癌細(xì)胞株的耐藥主要是由于 MRP-3的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致胞內(nèi)藥物濃度降低所產(chǎn)生;而MRP-3的反義寡核苷酸可抑制其表達(dá)。

本研究結(jié)果表明,肝癌耐藥細(xì)胞株中 MRP-3的表達(dá)明顯增加,而用反義鏈MRP-3 cDNA可使表達(dá)MRP-3的細(xì)胞株恢復(fù)對(duì)阿霉素的敏感性,所以 MRP-3的表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的化療藥物耐藥有著極大的關(guān)系,且針對(duì) MRP-3基因表達(dá)的干擾能有效地逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的多藥耐藥,增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,這在腫瘤的基因治療方面也顯示了可觀前景。

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