Smac/DIABLO與腫瘤治療的研究進展

魏 巍 初 明 劉 爽

(佳木斯大學附屬第一醫院骨二科,黑龍江 佳木斯 154002)

靶向性治療一直是腫瘤治療的研究熱點,腫瘤細胞與正常細胞區別主要在于:腫瘤細胞具有無限增殖,逃避凋亡,組織侵襲性以及轉移的能力。如何在治療過程中只殺死腫瘤細胞而不影響正常細胞是治療腫瘤的難點。Smac/NIABLO是 2000年首先由 Wang等〔1〕發現并報道,命名為第 2個線粒體衍生的胱天蛋白酶激活劑(second mitochondria-derived activator of caspase,Smac),確定其位于線粒體中,在凋亡過程中與細胞色素 C一同由線粒體中釋放出來,與細胞凋亡密切相關。同年,Vaux等〔2〕也報道了這個蛋白,命名為低等電點凋亡抑制蛋白(IAPs)直接結合蛋白(direct IAP-binding protein with low pI,NIABLO)。經過比對分析證實兩者為同一種蛋白,即命名為Smac/NIABLO蛋白。近年來,Smac/NIABLO只誘導腫瘤細胞凋亡而不影響正常細胞的特點引起各國研究人員的注意,希望可以將其應用于腫瘤靶向治療。

1 Smac/NIABLO蛋白的生物學特性

人類 Smac/DIABLO基因位于 12號染色體長臂,由 7個外顯 子 組 成。Smac/DIABLO有 Smac/DIABLO-L、Smac/DIA 2BLO-S和野生型 Smac/DIABLO 3種存在形式。Smac/DIABLO-L、S蛋白存在于線粒體內;而野生型的 Smac/DIABLO蛋白以純二聚體的形式存在于線粒體的膜間隙內〔3,4〕。

Smac/NIABLO分子的 N端是由 55個氨基酸構成的信號肽序列,Smac/NIABLO前體在進入線粒體后立即被水解去信號肽,只有水解后的Smac/NIABLO才具有活性。經 Western印跡實驗測出有功能活性的Smac/NIABLO是 184個氨基酸殘基,分子量約 21 000〔3,4〕。在 2.2 A分辨率的 X線下,Smac/NIABLO單體是一個延伸的 3個螺旋多肽鏈組成的束狀結構,有中度彎曲,呈拱形。在生理緩沖液中,天然Smac/NIABLO呈二聚體狀態。單體型 Smac/NIABLO不能解除XIAP對 caspase的抑制作用。這說明 Smac/NIABLO二聚體狀態對其功能來說是必需的〔5,6〕。 2002年 GuoO等準確定位 Smac/NIABLO的功能集團,即 N端前 5個殘基與其活性緊密相關〔7〕。用甲硫氨酸代替Smac/NIABLO其 N端的丙氨酸,則Smac/NIABLO完全不能與IAPs的BIR區域緊密結合而發揮其作用。當Smac/NIABLO缺失其 N端的前 4個氨基酸殘基(A-V-P-I)時,其與 IAPs的結合能力極度減弱。可見 Smac/NIABLO的功能集團主要位于 N端,C端輔助其與 IAPs結合緊密〔8〕。在抗腫瘤藥物的開發上,分子量小的蛋白在應用上更加好操作,更少副作用,因此研究人員更加青睞 Smac/NIABLO蛋白的N端小肽。

2 Smac/NIABLO對細胞凋亡的調控作用

2.1 細胞凋亡的信號途徑 細胞凋亡是一個復雜的生理過程。一般認為細胞凋亡分為受體凋亡途徑與線粒體凋亡途徑,包括 3個階段:誘導期(induction phase)、效應期(effector phase)、降解期(degradation phase)。各種刺激經相應受體,通過效應分子相互作用引起 caspase家族的級聯反應,降解細胞內容物,隨之出現細胞凋亡現象。其中 caspase酶的級聯反應被視為大多數凋亡過程中細胞死亡效應期的關鍵反應,因此控制 caspase的級聯反應就是控制細胞凋亡的樞紐。雖然受體途徑與線粒體途徑所引發的 caspase級聯反應途徑不同,但在某些水平是相互聯系的(如圖 1所示)。

圖1 細胞凋亡信號傳導示意圖

2.2 Smac/NIABLO調控細胞凋亡的機制 細胞凋亡每一步驟都受到嚴格精確的調控。Bcl-2蛋白家族可以激活 caspase酶原,誘導細胞凋亡,而凋亡抑制蛋白家族(IAPs)可以抑制caspase的級聯反應,從而阻斷細胞凋亡進程〔9〕。Smac/NIABLO可以與 IAPs家族成員 XIAP、c-IAP-1、c-IAP-2、survivin等蛋白分子普遍反應,通過除去IAPs的抑制作用使caspase酶原活化,進而達到促使細胞凋亡的作用。Smac/NIABLO能與IAP反應是因為 IAP家族的所用成員都至少含有 1個 BIR基序。實驗表明,不同的BIR區域表現出不同的功能,在 Fas誘導的凋亡中,內源性的 XIAP水解成為二部分,每一部分都有不同的caspase的特異識別位點,XIAP的第二個BIR區域(BIR2)表現出強的抑制凋亡的能力,而BIR1區域與BIR3區域卻未顯示出同樣活性〔10〕。實驗數據顯示 Smac/NIABLO可與 XIAP的 BIR2和 BIR3區域穩定反應,而與 BIR1區域則無反應。另外,BIR2、BIR3在與Smac/NIABLO結合過程中互相排斥,提示它們可能識別Smac/NIABLO的同源基序。BIR2可以抑制成熟caspase-3的催化活性,而 Smac/NIABLO與 BIR2區域結合可解除其抑制。在凋亡因子刺激下,位于細胞膜上的 caspase-8活化,但被XIAP阻滯,這需要Smac/NIABLO由線粒體中釋放來中和XIAP的作用,才允許 caspase-8直接激活效應器,導致細胞凋亡〔11〕。由此可見 Smac/DIABLO和 IAP是一種競爭性作用,因此可以通過增加Smac/DIABLO表達量實現促進細胞凋亡的目的。此外 Smac/DIABLO還具有其他機制來調節IAP功能。研究發現,Smac/DIABLO可以選擇性地使 c2IAP1和 c2IAP2泛素化降解而導致兩者濃度降低〔12〕,這樣可以進一步增加 Smac/DIABLO的相對濃度,促進細胞凋亡。

3 Smac/NIABLO在腫瘤治療中的應用

3.1 Smac/NIABLO與腫瘤進展的相關性 對于 Smac/NIABLO與腫瘤分期以及癌組織分型的相關性目前結論尚未統一。有的研究發現 Smac/NIABLO在惡性程度高、低分化的腎細胞癌中蛋白表達水平明顯低于惡性程度低、高分化的腎細胞癌〔13〕,在肺癌的進展過程中 Smac/NIABLO的表達水平降低。而有的研究則發現 Smac/NIABLO蛋白表達水平與腫瘤分期及癌組織分型無關,或者蛋白表達水平與 mRNA表達水平不一致。目前可以達成共識的是,Smac/NIABLO與XIAPs的比值在Ⅲ期腫瘤中明顯高于Ⅰ期與Ⅱ期腫瘤,在高轉移性腫瘤中明顯高于原位癌〔14〕。可見腫瘤進展過程是一個復雜的多方面作用的綜合結果,其中Smac/NIABLO與 IAPs蛋白的比值在腫瘤細胞逃避凋亡、無限制的增殖過程中有重要意義。

3.2 Smac/NIABLO與腫瘤治療 自 2003年 Kashkar等〔15〕報道過表達 Smac/NIABLO可以促使神經母細胞瘤凋亡,這一發現推動了 Smac/NIABLO作為生物靶向分子,輔助抗腫瘤藥物的研究。例如,乳癌MCF-7細胞系屬于惡性度高、對誘導凋亡藥物不敏感的細胞,利用哺乳動物 GFP-Smac/NIABLO表達系統使其在細胞質中表達 GFP-Smac/NIABLO融合蛋白,并轉變為對死亡受體敏感的細胞〔16〕。研究表明,過表達 Smac/DIABLO可以使腫瘤細胞對凋亡刺激更加敏感。在種植肝癌細胞株的裸鼠模型,局部注射可以高表達 Smac/NIABLO的腺病毒載體與 5-氟尿嘧啶,發現腫瘤細胞出現大量凋亡,瘤塊明顯縮小甚至消失〔17〕。尤其是Smac/NIABLO蛋白 N端分離下來的短氨基酸序列也可與 XIAP反應,作為 caspases的活化劑提高caspase-9、caspase-3的活化能力,一定濃度還可以殺傷 IAPs過表達的腫瘤細胞。Christina等〔18〕采用 Smac蛋白衍生的含有A-V-P-I氨基酸基序的小分子肽能增強細胞凋亡和多種抗瘤藥物的治療效果。對不同腫瘤細胞系的研究發現,高表達 Smac小肽可促進腫瘤細胞凋亡并增加腫瘤細胞對化療的敏感性,但Smac/DIABLO并不誘導正常的細胞凋亡〔14〕。因此聯合 Smac小肽和抗癌藥物進行腫瘤治療,一方面可以增加藥物效果,另一方面還可以減少藥物毒性。由此可見,Smac/DIABLO小肽分子作為抗腫瘤藥物的輔助劑與抗癌藥物聯合應用具有廣泛的應用前景。

4 展 望

雖然目前在一些腫瘤細胞中發現Smac/NIABLO蛋白表達水平與 mRNA表達水平不一致之類的問題尚未完全解決,但對于 Smac/NIABLO蛋白近 10年的研究過程中,將細胞凋亡的基礎研究工作向更深層次推進,令細胞凋亡機制的細節更完善;而且研究開發了 Smac/NIABLO蛋白對腫瘤臨床治療的應用價值,使得在腫瘤的生物大分子治療方面有了重大突破。

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