組織因子途徑抑制物-1與深靜脈血栓形成的研究進展

寧 亞 李 文

(昆明醫學院第一附屬醫院骨科,云南 昆明 650032)

深靜脈血栓 (DVT)指深靜脈管腔內血液的異常凝結,常見于創傷或手術后患者,好發于下肢,若不及時發現并對其進行有效治療,早期可因血栓栓塞局部深靜脈管腔導致疼痛性股青腫,或血栓脫落繼發致命性肺栓塞;晚期遺留深靜脈瓣功能不全,成為嚴重危害患者健康的疾病之一。血液中存在一套相互拮抗的凝血和抗凝血系統,在正常情況下,通過復雜而精細的調節保持動態平衡,既維持血液在血管內呈液體流動狀態,又在一旦出現血管破裂的情況下迅速在局部凝固形成止血栓,防止出血。若凝血和抗凝血過程中出現調節障礙或凝血系統在心血管內被不適當激活,從而造成血栓形成。因此,研究血栓形成的分子機制,明確其核心調控因素,找到特異、靈敏、快速早期預測診斷 DVT形成的分子標記物并明確有效的藥物靶點將對 DVT高危患者進行更有針對性、個性化防治具有重大現實意義。組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)為庫尼(Kunitz)型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族蛋白,分為 TFPI-1和-2。但二者在基因序列、組織來源、分布及其生理作用等方面存在較大差異。TFPI-1作為外源性凝血途徑的特異性抑制物,在抑制血栓形成和血管重塑等方面發揮重要作用;還與炎癥、動脈粥樣硬化(AS)、腫瘤、敗血癥等疾病相關〔1〕,其重要的生理學意義和對血栓性疾病的治療價值引人關注。本文主要綜述 TFPI-1在DVT相關方面的研究進展。

1 TFPI-1來源與分布

TFPI-1主要由微血管內皮細胞合成,血管平滑肌細胞、成纖維細胞、單核/巨噬細胞、腎小球細胞、心肌細胞以及血小板、T淋巴細胞等其他細胞也有少量表達〔2〕。TFPI-1在體內的分布大致分為 3部分:①結合于內皮細胞腔面,占總量的 50%～80%;②血液中占 10%～50%,大部分與脂蛋白結合,小部分以游離形式存在;③血小板中約占 8%。Dahm等發現總 TFPI-1和游離型 TFPI-1減少是 DVT的危險因素〔3〕。正常人血漿 TFPI-1含量為 54～142 ng/ml,在體內由肝和腎負責清除,凝血酶和肝素可改變體內 TFPI-1分布。

2 TFPI-1結構特點

2.1 基因結構 TFPI-1的編碼基因定位于 2q31-2q32,基因全長 70kb,包括 9個外顯子和 8個內含子。外顯子 1和 2編碼TFPI mRNA的 5′端非翻譯區,外顯子 3編碼信號肽及N末端,外顯子 4、6、8分別編碼 TFPI的 K 1、K 2和 K 3結構域,外顯子 5和 7編碼 K 1、K 2和 K 3之間的兩段連接區,外顯子 9編碼 C末端和 3′端非翻譯區。TFPI-1 mRNA啟動子沒有典型的 TATA盒和 CAAT盒,而是在 5′側區的 508和 521胞嘧啶上有兩個轉錄起始點〔4,5〕。

2.2 蛋白結構 TFPI-1是 276個氨基酸殘基組成的耐熱單鏈糖蛋白,由 3個重復的 Kunitz結構域(K1、K 2和 K 3)、一個富含酸性氨基酸的 N端和一個富含堿性氨基酸的C端構成。TFPI-1所含 18個半胱氨酸殘基構成 9對二硫鍵,參與維持其二級結構。結構域 K1和 K 2是 TFPI發揮抗凝活性的關鍵部位,分別與 TF/VⅡa復合物和FⅩa發生靜電相互作用,最后形成TFFVⅡa-TFPI-Ⅹa四聚體,中斷外源性凝血途徑級聯反應〔6〕。結構域 K3和 C端可以和肝素、膜表面糖蛋白及多糖結合〔7〕,無直接抑制蛋白酶的功能,但它和C端對于肝素和細胞表面的結合是必需的,對TFPI-1的整體抗凝活性具有重要意義,并對 K 2結構域結合到 FⅩa上可能起定位作用〔8〕。

3 TFPI-1生理功能

3.1 TFPI-1與外源性凝血途徑 1964年,MacFarlane和Davie等分別同時提出了凝血瀑布學說。隨后,逐漸形成了凝血理論的傳統瀑布學說,認為凝血過程由外源途徑(extrinsic pathway)、內源途徑(intrinsic pathway)和共同途徑(common pathway)組成,其中外源性凝血途徑是生理性止血的主要途徑。血管內皮細胞受損時,內皮下細胞表面組織因子(TF)暴露于血液,外源性凝血途徑立即啟動。TF與血液中少量的 FⅦ(FⅦa)結合,形成 FⅦa/TF復合物,而后活化 FⅩ和少量 FⅨ,活化的 FⅩ(FⅩa)激活凝血酶原變為凝血酶,從而引起凝血,少量 FⅨa對 FⅩ的激活則產生放大作用。Lu〔9〕等人通過反應動力學實驗發現,生理條件下 FⅦa/TF活化的產物中,FⅨa的活性明顯超過 FⅩa的活性,提出外源性凝血途徑的早期是以 FⅨ 活化為主,而 FⅩa則更傾向于是 FⅨa的活化產物。

外源性凝血途徑主要受 TFPI-1抑制調節,其對FVⅡa/TF復合物的抑制作用是通過兩步完成:①TFPI-1通過K2與活化的 FⅩa結合,形成 FⅩa/TFPI-1復合物,競爭性地抑制 FⅩ的活性,該過程是一個 Ca2+非依賴的可逆性過程,但必須有因子Ⅹa的活性基團及 TFPI-1的 K2抑制區的作用;②FⅩa/TFPI-1復合物中的 TFPI-1通過K 1與 FⅦa/TF復合物中的 FⅦa活性部位結合,從而實現對 FⅦa/TF復合物的抑制。FⅩa輕鏈中谷氨酸殘基上的 γ-羧基與 Ca2+結合,并通過“鈣橋”結合于 FⅩa/FⅦa/TF復合物中 TF附近的磷脂表面,使得 FⅩa/TFPI-1與Ⅶa/TF形成穩固的FⅩa/TFPI-1/Ⅶa/TF復合物,該復合物可以被單核細胞和內皮細胞等吞噬清除。TFPI-1對 VⅡa/TF的抑制反應是一種化學定量反應,并且每一步都是可逆的。TFPI的 K1與K 2抑制區是其發揮作用的主要位點,在抑制過程中具有重要意義。FⅩa/TFPI-1復合物在外源性凝血途徑活化的起始階段對 FⅦa/TF進行抑制,從而在根本上阻斷 FⅩ和FⅨ的大量活化,避免了凝血因子及抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)等抑制因子的大量消耗。由此可見,TFPI-1在外源性凝血途徑的負反饋調節中發揮重要作用。

3.2 TFPI-1與肝素的抗凝作用 肝素是臨床上應用最多的抗凝藥物,其通過與 AT-Ⅲ結合,增強后者的抗凝活性而發揮間接抗凝作用〔10〕,同時還抑制凝血因子 FⅨ a、FⅩ a、FⅪa和 FⅫa的活性。Hansen等〔11〕研究結果表明,肝素可以促進培養的人血管內皮細胞 TFPI-1的分泌。

王建文等〔12〕研究結果表明,無肝素連續血液凈化治療過程中,TFPI-1呈上升趨勢,而使用肝素抗凝其上升幅度更為顯著,且呈劑量依賴性增加,說明肝素可通過增加血管內皮細胞分泌TFPI-1而增強其抗凝作用。此外免疫阻斷TFPI-1,肝素的抗凝效果明顯下降,表明肝素的抗凝作用有賴于 TFPI-1。體外實驗還發現,肝素和TFPI-1還具有協同作用。故可以認為肝素的抗凝作用與 TFPI-1有密切的關系。

Vignoli等〔13〕研究顯示,肝素可抑制炎癥介質(脂多糖)誘導的內皮細胞組織因子 mRNA表達量及活性。Mousa等〔14〕發現不同分子量的肝素對血漿TFPI-1的影響不同,低分子量肝素可使內皮細胞 TFPI-1的合成和分泌增加。

4 TFPI-1研究進展

4.1 TFPI-1基因多態性與 DVT DVT受多因素、多系統調控,調控機制復雜。是凝血-抗凝、纖溶-抗纖動態平衡破壞的最終結果。一方面由于體內異常凝血的復雜性,另一方面是由于缺少合適的動物模型和前沿研究手段,致使 DVT的機制研究滯后。其病因和發病機制尚未清楚,但大量流行病學研究結果表明,遺傳基因在DVT發病過程中可能起著重要的作用。TFPI-1基因存在著基因變異及基因多態性,目前許多國內外學者試圖從分子遺傳學角度探討 TFPI-1基因多態性是否與DVT相關,從而進一步揭示DVT的發病機制。

Miyata等〔15〕首次報道 TFPI-1 C-399T(CTT-TTT)轉換,并認定該突變并不改變TFPI-1蛋白的表達,亦與靜脈血栓形成無關。Kleesiek等〔16〕發現靜脈血栓形成患者 P151L多態性的頻率高于志愿者,認為P151L與易栓癥顯著相關,并與靜脈血栓形成危險性有關。Amezianne等〔17〕認為內含子 7CC基因型是靜脈血栓形成的獨立危險因素,可能是介導TFPI-1水平升高的作用。Sidelmann等〔18〕臨床試驗結果表明,急性 DVT形成患者較無血栓患者 TFPI-1的濃度顯著升高,而此與-33T/C多態性、內皮細胞炎癥等無關,可能與纖維蛋白沉淀中TFPI-1的釋放有關。姜劍軍等〔19〕采用聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性分析及DNA測序,對比了 62例 DVT患者和 50例正常漢族人的 TFPI-1基因序列,認為 TFPI-1基因可能不是中國漢族人 DVT的主要易感基因,但 5號內含子中單核苷酸“G”插入有深入研究價值。劉秀娥等〔20,21〕實驗結果表明,TFPI-1基因 C-399T多態性與靜脈血栓形成易感性有關,純合突變基因型可能是靜脈血栓栓塞的重要危險因素;T-287c與TF啟動子-1208I/D基因多態性與我國人群靜脈血栓栓塞發病沒有顯著相關性,該基因可能不是中國漢族人的易感基因。

目前 TFPI-1基因多態性與DVT形成的關系研究仍處于初始階段,對其是否是DVT的遺傳性危險因素尚無定論,可能存在基因多態性之間的相互作用或連鎖不平衡等機制,尚有待于進一步多地域、多種族、大樣本量廣泛深入研究,從而可能為DVT的風險預測、防治提供一條新的線索和途徑。

4.2 重組 TFPI-1對 DVT的防治 TFPI-1與 DVT關系密切,天然 TFPI-1在正常人體內含量極少、提取率很低較難獲得,目前國內外已有多種生產重組 TFPI-1(rTFPI-1)的方法,也已有相應產品面市,并陸續開展臨床試驗。通過動物實驗已經證明,rTFPI-1能明顯提高或延長大鼠、小鼠、豬等感染性休克和彌散性血管內凝血(DIC)模型動物的存活率,減輕炎癥反應、抑制凝血反應和防止血栓形成,減輕肺、脾、肝、腎等臟器損傷〔22,23〕。 Yin等〔24〕報道,在血管壁進行 TFPI-1基因轉移可防止局部血栓形成和狹窄而無出血危險。Chen等〔25〕通過對小鼠模型的研究,推測靶向應用rTFPI于內皮細胞,可改善全身抗凝治療,同時盡量減少潛在出血的副作用。Holst等〔26〕證明使用重組人 TFPI-1-161(即缺乏 K 3和 C末端的 TFPI)治療兔頸靜脈血栓時,有著與肝素同樣的效力,但出血等不良反應明顯減少。因此,rTFPI-1有可能取代肝素應用于術后 DVT的預防和治療。Klement等〔27〕認為雖然 rTFPI-1等抗凝藥物部分在臨床試驗中顯示了良好的效果,但大部分仍處于動物動/靜脈血栓模型階段,抗凝血過程同時會影響到傷口愈合、炎癥、血管生成、細胞分裂、凋亡等過程,所以需進一步發展和嚴格的審核。

5 展 望

隨著分子生物學與基因工程的發展與應用,人們將會進一步了解 TFPI-1的抗凝作用機制,明確其基因多態性與 DVT的聯系,TFPI-1有望作為一種簡便、安全、快速、特異性和準確性高的 DVT預測診斷分子標記。而安全、高效的rTFPI-1藥物也將研制成功并應用于臨床,在測 DVT的防治、降低 DVT危害性、減輕傳統抗凝治療出血副作用等方面發揮積極作用,具有極大的社會效益和經濟效益。

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