負載肝癌抗原樹突細胞瘤苗對癌細胞免疫抑制作用

馬玉強 張明輝

(唐山市人民醫院腫瘤醫院,河北 唐山 063000)

樹突細胞(DC)是體內功能最強的抗原遞呈細胞,在機體抗腫瘤免疫應答的誘導中發揮重要作用〔1〕。研究發現,將腫瘤患者外周血單個核細胞分離后在體外采用相關的細胞因子進行活化,然后加入自體肝癌細胞裂解物致敏,將致敏的DC與自體 T淋巴細胞共培養后,誘導產生特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)免疫,發揮抗腫瘤免疫效應〔2〕。DC瘤苗抗腫瘤研究正成為腫瘤生物學治療的新熱點。近期研究表明,腫瘤患者DC免疫功能低下〔3〕。如果制備 DC瘤苗回輸患者體內,可激發針對肝癌抗原細胞的 T淋巴細胞免疫,有望在肝癌術后的治療中發揮作用。為此,我們應用肝癌細胞裂解物致敏的DC瘤苗,觀察刺激術后與術前自體T淋巴細胞增殖能力及抑制腫瘤細胞免疫作用的情況,為肝癌 DC瘤苗用于肝癌患者術后的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2007年 10月至 2008年 9月唐山市人民醫院收治的肝癌患者 8例,均無遠處轉移灶,無嚴重臟器功能不全,術后病理活檢為肝細胞性肝癌。

1.2 方法

1.2.1 肝癌細胞及其裂解物的制備 將手術切除的肝癌組織剪碎,經膠原酶Ⅳ、DNA酶消化后制成細胞懸液,用 100%和75%的淋巴細胞分離液分離,收集管底的肝癌細胞,將 5×106自體肝癌細胞在-70℃和 37℃下,反復凍融、篩網研磨、離心和經超聲破碎,取上清液經 0.2μm濾膜過濾即為肝癌細胞裂解物,凍存備用。

1.2.2 DC體外培養、擴增及鑒定 取肝癌患者術前與術后外周血各 50ml,肝素抗凝,常規分離外周血單個核細胞(PBMC),放置 37℃,5%CO2孵箱中培養 2 h后,吸出未貼壁細胞,留下貼壁細胞,加入含 rhGM-CSF 1 000 U/ml和 rhIL-4 500U/ml等細胞因子的培養液,隔日加細胞因子(首次濃度的 1/2)和培養基,培養 7d收集的細胞即為樹突狀細胞。

1.2.3 肝癌細胞裂解物致敏DC的制備 在肝癌患者外周血DC體外培養的第 6天,加入肝癌細胞裂解物(120μg/ml)共培養,過夜收獲貼壁的細胞即為致敏DC瘤苗。

1.2.4 T淋巴細胞制備 取肝癌患者術前與術后外周血各100ml,分離PBMC,置 37℃、5%CO2培養箱孵育 3h,去除貼壁細胞,非貼壁細胞用含 5%AB型血清的 RPMI1640懸浮,注入尼龍毛柱,37℃孵育 1h,沖洗出非黏附細胞即為T淋巴細胞。

1.2.5 肝癌DC瘤苗對自體T淋巴細胞增殖的影響 收集誘導第 8天的術前負載肝癌抗原的肝癌 DC瘤苗,調整細胞濃度為 1×105/ml,加入絲裂霉素 C 25μg/ml,37℃孵育 45 min,PBS洗 3次,完全培養基懸浮,然后與術前自體 T淋巴細胞(1×106細胞 /孔)按 1∶10的比例混合,鋪 96孔培養板(200μl/孔),同時設自體 T淋巴細胞(106細胞/孔)對照,置 37℃、5%CO2孵箱培養 48h,加入 MTT(5 mg/ml)10μl繼續培養 8 h。輕輕吸棄培養上清,加入 DMSO 100μl/孔,于 570nm處測定 A值。按公式計算 T淋巴細胞及CD8+T細胞增殖指數;同理,再將收集培養的術后肝癌DC瘤苗與術后提取的自體T淋巴細胞按以上實驗操作,計算增殖指數。增殖指數(%)=實驗組 A值/對照組 A值(%)。

1.2.6 肝癌DC瘤苗刺激自體 T淋巴細胞分化為CTL及CTL對自體腫瘤細胞殺傷活性檢測 于 6孔板中加入術前自體 T淋巴細胞(1×106細胞/孔)、術后肝癌 DC瘤苗(1×105細胞/孔)以及 IL-2 200U/ml,置 37℃、5%CO2孵箱中培養,分別于培養的第 3、6天換液、擴增,收集第 4～6天培養 72h的上清備用。第 7天收集細胞,即為 CTL。流式細胞術檢測 CTL分型、采用乳酸脫氫酸(LDH)4 h釋放法檢測 CTL的殺傷活性。以CTL作為效應細胞,以自體肝癌細胞為靶細胞,效靶比為 25∶1,同時設效應細胞和靶細胞對照孔。置酶標儀測 490 nm的OD值,按公式計算CTL的殺傷率。以反映肝癌DC瘤苗及其活化CTL對肝癌細胞的作用。殺傷率(%)=(OD實-OD空)-(OD效-OD空)-(OD靶-OD空)/(OD靶最大釋放-OD靶校對)-(OD靶自然釋放-OD空)×100%。

1.3 統計學方法 應用 SPSS12.0統計軟件進行統計分析。結果以 x±s表示,兩組均數比較用 t檢驗。

2 結 果

2.1 肝癌DC瘤苗對自體T淋巴細胞增殖的影響 將負載肝癌抗原的肝癌 DC瘤苗與術前及術后自體T淋巴細胞共培養后,用流式細胞儀檢測T淋巴細胞增殖情況,肝癌DC瘤苗刺激術后自體 T淋巴細胞增殖能力及抑制腫瘤細胞作用顯著強于對術前自體 T淋巴細胞的作用,T淋巴細胞增殖指數術后(1.86±0.15)較術前(1.18±0.13)顯著增高、CD8+T細胞增殖指數術后(1.55±0.35)較術前(0.95±0.12)增加顯著,差異均有統計學意義(均P＜0.05)。其中 T淋巴細胞亞群 CD8+T細胞增加顯著,肝癌DC瘤苗刺激術后自體 T淋巴細胞增殖指數顯著強于刺激術前自體T淋巴細胞,差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 肝癌DC瘤苗及其活化CTL對肝癌細胞的作用 未加肝癌 DC瘤苗培養的腫瘤細胞狀態良好,呈進行性生長,肝癌 DC瘤苗活化的術前自體CTL對自體肝癌細胞殺傷率,與肝癌 DC瘤苗活化的術后自體 CTL對自體肝癌細胞殺傷率比較顯示,肝癌 DC瘤苗活化的術后自體 CTL對自體肝癌細胞有較強殺傷作用,殺傷率由術前的(32.35±2.26)%增加到術后的(69.80±3.45)%,肝癌DC瘤苗活化的術后自體 CTL對自體肝癌細胞有較強殺傷作用。而二者對自體二倍體細胞無明顯殺傷作用(術后為 1.59±0.55)。

3 討 論

在腫瘤患者微環境下,腫瘤細胞通過分泌某些細胞因子對DC產生功能抑制,如血管內皮生長因子(VEGF)有胚胎發育過程中,在腫瘤新生血管生成過程中起了關鍵性作用。實驗證明,許多腫瘤能分泌VEGF,VEGF在體內體外均能導致DC的分化及功能缺陷〔4〕。 Rinaldi等〔5〕證實,腫瘤細胞表達相關抗原 GA 733-2,影響局部浸潤的 DC表面 MHC-Ⅱ類分子的表達,從而影響 DC對 T細胞抗原的遞呈和激活。Xie等〔6〕在對肝癌的研究中發現,由于血清甲胎蛋白(AFP)的存在,腫瘤組織中浸潤的 DC表面不表達 CD86,CD80和 CD40,不能有效遞呈腫瘤抗原。Holmstrom等〔7〕研究發現肝臟 DC的 TLR4 mRNA的表達降低,如果將腫瘤局部浸潤的 DC在體外用 GM-CSF及TNF或 CD40L刺激,DC不表達 CD80,CD86等共刺激分子,呈現未成熟 DC的表型特征,因此,DC在分化過程中存在缺陷。DC數量少,在腫瘤患者早期的外周血中DC的含量可比正常人少一半以上,而在晚期患者這種差異可達 4倍以上,單純這種數量的降低即可使腫瘤細胞免疫刺激變得相對沒那么有效〔8〕。

當腫瘤細胞被切除后,患者體內抑制DC成熟的各種因素作用減弱,機體內DC分化及功能逐漸恢復正常,最直接的證據是當腫瘤被切除后,抑制單核細胞分化發育的微環境被解除,單核細胞可以正常分化為未成熟DC,這時未成熟DC遇到腫瘤抗原后,其表面表達 MHC-Ⅱ類分子以及 CD40,CD80,CD86等共刺激分子增加,IL-12分泌增多,即成為成熟 DC〔9〕。成熟的DC常表達CC趨化因子受體 7(CCR7),它的表達增加有利于DC向引流淋巴結遷移,在那里DC能遇到初始T淋巴細胞并誘導免疫反應的發生〔10〕,只有成熟 DC能刺激初始型 CD4+T淋巴細胞,通過 TH1細胞分泌細胞因子 IL-12,IFN-γ,TNF等參與細胞免疫的調節,能夠激活CD8+T細胞又稱為CTL,直接發揮細胞毒作用,殺傷腫瘤細胞,通過分泌釋放效應細胞因子如穿孔素,顆粒酶,淋巴毒素,TNF等引起靶細胞裂解或凋亡〔9〕。故術前肝癌患者體內,腫瘤細胞分泌的細胞因子對樹突細胞的分化和發育影響較大,而術后肝癌患者體內腫瘤細胞分泌的細胞因子對樹突細胞的影響較小。同時腫瘤可誘導 T細胞成分和功能紊亂,有人研究分析荷瘤小鼠的胸腺中 T細胞亞群的比例失衡,細胞免疫功能異常,而且淋巴因子的功能亦可發生失調,Th1可分泌 IL-2,IFN-γ等細胞因子,參與細胞免疫調節,激活CD8+T細胞,增強其殺傷能力,或促進靶細胞 MHC-1類分子的表達,提高其對CTL的敏感性,抗腫瘤免疫應以 Th1型細胞介導的細胞免疫為主〔11〕,Th-2分泌 IL-4,IL-10等細胞因子,IL-4,IL-10是抑制 Th1應答和介導 Th2發育的主要細胞因子,yamamura和kharkevitch最早發現腫瘤患者體內 Th2型細胞因子較 Th1型細胞因子處于優勢狀態,也就是說腫瘤患者體內術前較術后 Th2型細胞因子處于優勢狀態;經手術后,肝癌患者體內腫瘤抑制因子含量明顯減少,用肝癌抗原刺激 DC,其表面可更多表達 MHC-Ⅱ類分子以及 CD40,CD80,CD86等共刺激分子,IL-12分泌更多,刺激 CTL的殺傷作用更強,使負載肝癌抗原的DC瘤苗對自身T淋巴細胞的激活作用,術后較術前效果顯著。

本實驗結果顯示,肝癌DC瘤苗刺激術后自體 T淋巴細胞增殖能力及抑制腫瘤細胞作用顯著強于對術前自體 T淋巴細胞的作用,T淋巴細胞增殖指數較術前顯著增高,CD8+T細胞增殖指數較術前增加顯著,而且肝癌 DC瘤苗活化的術后自體CTL對自體肝癌細胞有較強殺傷作用,證明肝癌DC瘤苗活化的術后自體 CTL對自體肝癌細胞的殺傷力明顯強于對術前CTL殺傷自體肝癌細胞的能力。

目前,肝癌的治療方法有手術、放療和化療,HCC根治術后,常因不能清除遠處轉移的微小病灶而易造成復發和轉移,化療或放療又摧毀了機體的免疫功能,而DC是體內功能最強的抗原遞呈細胞,在抗腫瘤免疫中發揮重要作用,目前由于肝癌特異性抗原尚不能明確鑒定〔11〕,制備 DC瘤苗回輸患者體內,可激發針對多個肝癌抗原的 T淋巴細胞免疫,減少了癌細胞逃逸的可能性,肝癌的生物治療在保護機體的免疫力的同時可以清除易造成轉移和復發的遠處微小病灶,副作用不顯著,成為繼手術、放療、化療后發展起來的腫瘤治療第 4大療法,本研究證實了肝癌的生物治療最好用于肝癌術后的患者效果更好。

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