洗胚對小鼠胚胎質量影響初探

周懂杰 蘇賀靖 張杰 陳森 陳韻穎 齊安龍 張熙浩 鄭小敏

(天津醫科大學臨床醫學院 天津 300270)

洗胚對小鼠胚胎質量影響初探

周懂杰 蘇賀靖 張杰 陳森 陳韻穎 齊安龍 張熙浩 鄭小敏

(天津醫科大學臨床醫學院 天津 300270)

本實驗探討了胚胎移植過程中洗胚對胚胎質量的影響。實驗對象是KM鼠,對實驗(不洗胚)組和對照(洗胚)組進行比較,結果顯示實驗組受體鼠產仔率為30.3%,對照組受體鼠產仔率為23.0%,實驗組明顯高于對照組,卡方檢驗P＜0.05,有統計學意義。從而得出移植過程中的洗胚對胚胎質量有一定影響的結論。

小鼠 胚胎移植 細胞胚胎 洗胚 成活率

小鼠作為一種最廣泛的實驗動物,其胚胎移植技術對于實驗動物學和生命科學具有重要意義。自20世紀50年代受精卵和早期胚胎的采集技術建立以來,人類對小鼠進行發育生物學研究,包括胚胎基因突變研究,轉基因動物模型的研究,基因打靶技術的研究等均需要胚胎移植技術。而其移植的成功率往往受多方面影響,例如胚胎的培養液成分、培養的氣體比例與溫度、胚胎發育階段、移植方式等。筆者認為移植過程中的物理操作可影響胚胎質量,從而影響胚胎成活率,而之前少有文獻報道,鑒于此,本文探討了傳統方法的胚胎移植中洗胚對胚胎質量的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

封閉群KM小鼠,清潔級,毛色光澤,無形態行為異常。飼養溫度（22±2）℃，濕度50%～60%。飲水充足,日糧全面,飼喂專門的小鼠飼料,4～5d更換墊料以保持清潔。雌雄鼠體重分別在25.3g, (27.6±1.8)g。雌鼠50日齡以上100只,實驗組和對照組各隨機取其中15只,相同條件飼養,剩余鼠做供體鼠處理。雄鼠60日齡以上50只,其中15只預備結扎。

1.2 實驗試劑與儀器

無菌手術器械(包括眼科剪、眼科鑷、玻璃分針、針線、生理鹽水等)孕馬血清促性腺激素(PMSG):由天津市華孚高新技術公司提供。人絨毛膜促性腺激素(HCG):由上海第一生化藥業公司提供。透明質酸酶、M2培養液、M16培養液、優質石蠟油:sigma公司。CO2細胞培養箱:上海博迅實業公司提供。體視解剖鏡、培養皿。

自制胚胎移植管:筆者為了減少由于系統誤差而引起的對胚胎的物理損傷,利用千分尺、鐵架臺及毛細吸管等裝置自制了精密胚胎移植管。方法如下:取一毛細吸管清洗后在洗液中浸泡過夜,再洗凈烘干,利用酒精噴燈拉制吸管,細端長約10～15cm內徑120～180μm,細端瞬間在火焰上燒成圓口。

1.3 假孕受體準備

首先對15只KM雄鼠進行輸精管結扎,以便制備受體鼠:腹腔注射麻醉后,鋪一治療巾于蠟盤上,四角訂好蛙丁,小鼠仰面躺上,張開四肢,用皮筋將四肢和蛙丁固定(或用透明有機玻璃固定)。75%酒精擦拭后采用腹部橫切口,暴露視野。輸精管前后結扎,然后中間剪斷。術后滴入適量青霉素和鏈霉素,縫合體壁和皮膚。碘伏擦拭后包扎并標號放入鼠盒精心飼養,注意保溫。

假孕受體鼠制備:胚胎移植前1d,將結扎鼠和雄鼠以2∶1的比例合籠,次日早上有陰栓者作為受體鼠待用。

1.3 供體準備

超數排卵[2]:中午12點注射PMSG,50IU/mL的比例每只鼠注射0.1mL。47h后的11～12點間注射HCG,每只鼠注射50 IU/mL, 0.1mL。

表1 table 1 將細胞期胚胎移入假孕0.5d的變體鼠內的實驗數據總結

在注射HCG后當晚,將供體鼠和雄鼠以2∶1的比例合籠,次日早上有陰栓的待用。

1.4 方法

本文采用輸卵管壁移植。供體鼠和受體鼠的制備在同晚進行,于次日晚7點進行胚胎移植。

1.5 胚胎采集

1.5.1 對照組用傳統方法 將小鼠處死,75%酒精擦拭,開腹找到子宮,去除其他組織。取其輸卵管,移入M2培養液的培養皿中,解剖鏡下撕開輸卵管壺腹部找到胚胎,然后用吸管將卵移入1mg/mL的透明質酸酶的培養液中,溶去卵丘細胞。解剖鏡下觀察當卵丘細胞散開時即把受精卵移入不含透明質酸酶的新鮮培養液中,吹洗胚胎8～10次,吸取放入M16培養液的培養皿中。37℃50mL/L二氧化碳培養箱中短暫培養。

1.5.2 實驗組采用改進的方法 取出輸卵管后直接移入透明質酸酶的M2培養液中,撕開壺腹部見卵溢出,待其顆粒細胞消解時,吸取上清液,注入M2培養液后再吸取上清液,反復稀釋后,小心地將其移入M16培養液的培養皿中。37℃50mL/L二氧化碳培養箱中短暫培養。

1.6 胚胎的吸取

植入之前將M16中培養的胚胎移入M2培養液中在轉移管中。裝入石蠟油到肩部,先在轉移管中一次吸入氣柱,少量M2培養液,氣柱,然后將胚胎吸入,每次吸入20枚,之后吸入少量培養液后再吸入一段氣柱。小心放置待用。

1.7 胚胎移植

麻醉受體鼠,背部朝上固定,75%酒精擦拭后作最后一肋中央縱切口。左右滑動皮膚,小心剪破體壁,用眼科鑷夾住脂肪墊帶出子宮,血管夾夾住脂肪墊。顯微鏡下在輸卵管傘端至壺腹部1/3無血管或少血管處刺破囊膜,再將裝胚胎移植管插入輸卵管內,當第3個氣柱進入后鏡下仔細檢查有無漏導入胚胎。松開止血夾,將脂肪墊,卵巢,子宮一并送回體內,左右兩側各導入完后滴入適量青霉素和鏈霉素,縫合體壁和皮膚。碘伏擦拭傷口后包扎。術后單獨飼養。根據胎齡推測預產時間。

2 結果

本文采用將1細胞期胚胎移入假孕0.5d的受體鼠內。將實驗數據列表表示(表1)。

用χ2檢驗,代入專用公式得χ2=5.68,P＜0.05有統計學意義。

3 討論

資料顯示小鼠受精卵在體外培養時常常不容易度過2細胞階段,表現為“雙細胞限制”,本文使用1細胞時期的胚胎移植來探討洗胚對其的質量影響,避免了這個問題。

在1細胞期的小鼠胚胎移植過程中去顆粒細胞是必經的一步,一般用透明質酸酶來消化顆粒細胞,而透明質酸酶也會對小鼠胚胎造成損傷,故傳統的方法是在消化完顆粒細胞后再用洗卵針對其吹洗8～10次,以消除其對胚胎的化學損傷。

由表1的數據可以看出經過胚胎移植管沖洗胚胎的對照組的胚胎移植成功率23.0%明顯低于沒有經過沖洗的實驗組30.3%。原因在于小鼠早期胚胎很小,易損傷,直徑約100μm。它由透明層包圍,透明層對其有保護作用。洗胚過程中的吹洗胚胎會對其外的透明層產生一定的物理沖擊,這種沖擊有一定的概率對透明層造成損傷,并最后影響其成活。胚胎移植是將早期胚胎從供體鼠的生殖道內取出,然后植入受體鼠的相應生殖道內。在胚胎采集的過程中,多次轉移胚胎,用透明質酸酶消化顆粒細胞后用培養液沖洗胚胎,雖然轉移管口已平滑,但是這個過程中不可避免地使胚胎受到物理損傷。這種損傷就有可能影響其分裂并最終影響胚胎的存活。

由于細胞體外條件還難以達到與體內相同的理想狀態,胚胎的體外發育與體內發育相比結果則存在明顯的不同。胚胎移植的成功率受到多方面因素的影響,如小鼠本身的品系問題、移植階段不同、移植方式不同以及胚胎取出后的環境影響等。在這里筆者不做深入探討。

此外,本實驗的產仔率偏低于一些文獻報道資料,可能與小鼠來源和其它移植設備因素有關。

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Ef fects of Embryo Washing on Embryo Qual ity in Mice

This study explored the ef fects of embryo washing on embryo quality in the embryo transfer process.The experimental subject was KM mice.Compared to experimental(Non- embryo washing) group and control(embryo washing) group,the resul t showed that the total birth rate of the experimental group was 30.3%,and the total birth rate of control group was 23.0%,which was lower than the experimental group's.Chi-square test showedP＜0.05,the dif ference was statistical ly significant.Then we draw a conclusion that the embryo washing in the transfer process af fects embryo quality in a degree.

Mice;Embryo transfer;Lcel l embryos;Wash embryos;Success rate

R11

A

1674-0742(2010)06(c)-0030-02

2010-03-15