超抗原 SEA原核表達及誘導淋巴細胞殺傷人肺腺癌細胞效果觀察

馮艷敏 孫嘉琳 胡坤 張世奇 朱秀珊 張云 陳自輝

放射治療、化學治療等傳統治療腫瘤的方法雖然殺傷作用強,但選擇性很弱,在殺傷腫瘤細胞的同時也大量殺傷正常細胞,導致治療效果難以令人滿意。提高細胞免疫能力以達到治療腫瘤的目的,是目前腫瘤生物治療研究的重要方向。把超抗原(superantigen,SAg)應用于腫瘤的免疫治療,是在抗腫瘤實驗研究的基礎上發展起來的一種新的腫瘤免疫治療研究模式[1-3]。超抗原是一類能直接激活某些T細胞亞型或 B細胞亞型的結構上相似的一類蛋白質,引起眾多細胞因子釋放,激活 T、B、抗原呈遞細胞(APC)、殺傷細胞(NK)等細胞;另一方面,也可導致免疫抑制、免疫耐受和無能應答[4]。金黃色葡萄球菌腸毒素 A(SEA)是金黃色葡萄球菌的產物,可直接與APC膜上的主要組織相容性復合體 MHCⅡ類分子的肽結合溝外側的高度保守區結合,使表達有T細胞抗原受體TCRV區的 T細胞大量激活[5],強烈誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性及細胞因子的產生。由于 SEA誘導的CTL對腫瘤細胞有強大的殺傷作用,因此應用 SEA進行抗腫瘤治療得到了人們的熱切關注[6]。外周血單核細胞(PBMC)是不均一的細胞群體,包括CD4T細胞、CD8T細胞、NK等免疫活性細胞。CD4T和 CD8T細胞亞群發揮特異性殺腫瘤效應,而NK細胞的殺瘤活性不具特異性,這些免疫細胞在腫瘤免疫中發揮主要作用。免疫細胞表面受體和相應配體結合后,通過信號轉導,活性增強,其殺瘤活性提高。超抗原為多克隆細胞激活劑,能在極低的濃度下激活免疫細胞[7]。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌BL21(DE3)為本實驗室保存;重組質粒pET22b-SEA由大連寶生物工程公司合成;IPTG為 Solarbio產品;His?Bind Buffer Kit蛋白純化試劑盒購于 Novagen公司;DNA及蛋白分子質量標準為 Promega公司產品;人肺腺癌細胞A 549購自中國科學院上海細胞所;人外周血白膜購自天津市血液中心;DMEM高糖培養基和胎牛血清(FBS)均購自 Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)為上海生工生物工程公司產品;胰蛋白酶、G 418、二甲基亞砜(DMSO)均為 Promega公司產品;

1.2 方法

1.2.1 目的蛋白的誘導表達：將重組質粒 pET22b-SEA轉化至大腸桿菌 BL21(DE3),挑取單菌落于 LB培養基中,37℃培養至 A 600≈0.5時,加 IPTG至終濃度 1mmol/L,30℃振蕩過夜培養,收集菌體,將菌體用 50mmol/L Tris-HCl pH 8.0懸浮,冰浴中超聲破菌,14 000 r/min離心10min分離上清液與沉淀,進行SDS-PAGE分析。

1.2.2 SEA蛋白的分離純化：將超聲波破菌后得到的沉淀用含 2mmol/L尿素的 50mmol/L、Tris-HCl pH 8.0洗滌 2次后,加入變性劑(8 mmol/L尿素,3mmol/L EDTA,50mmol/L Tris-HCl pH 8.0)溶解包涵體,14 000 r/min離心 10min,收集上清液,將變性后的上清液裝入透析袋中,在 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0中,4℃下過夜透析。將透析后所得溶液 14 000 r/min離心 10m in,去掉透析過程中形成的沉淀,上清液用 His?Bind Buffer Kit進行純化,膠床先用 1×Binding Buffer平衡后,將之與樣品蛋白進行結合,用 1×Washing Buffer漂洗 3遍,1×Elute Buffer洗脫 4遍。收集洗脫液,用 SDS-PAGE對產物進行鑒定。

1.2.3 PBMC的分離：取健康成人外周血(含抗凝劑),用0.9%氯化鈉溶液 1∶1稀釋成血液稀釋液,將稀釋液緩慢加至含淋巴細胞分離液的離心管中(稀釋液與淋巴細胞分離液的比例為 2∶1),2 000 r/min,離心 20min。小心吸取單核細胞層,加入 4倍體積的 DMEM高糖培養基,混勻,2 000 r/m in,離心10min,棄去上清,重復 1次,最后加入 DMEM完全培養基制備成細胞懸液,細胞密度為 2×106/ml,于 5%CO2、37℃孵育培養。

1.2.4 SEA蛋白誘導 PBMC殺傷人肺腺癌細胞 A549：取對數生長期的 A549細胞胰酶消化成單細胞懸液,用含 10%FBS的DMEM完全培養基將腫瘤細胞濃度調至 2×105/ml,100μl/孔鋪于 96孔板中;將純化后的 SEA蛋白原液用 20 mmol/L HEPES進行 10倍順序稀釋,使 96孔板每孔 SEA終濃度分別為10、1、0.1、0.01 g/ml,加入相應孔中與細胞共育,每組設 6個復孔;同時效靶比設 5∶1、10∶1和 20∶1 3組對照,加 PBMC 100μl/孔與癌細胞混合;將 96孔板置于 37℃、5%CO2培養箱中孵育培養,分別于 12、36、60h后測定 PBMC的殺瘤活性。另設空白、效應細胞、靶細胞對照。

1.2.5 MTT法測定殺瘤活性：每孔加入 MTT(5 g/L)11 L,繼續孵育 4 h,取出離心,棄上清,加入 150μl DMSO,以 490 nm波長檢測各孔吸光度(A)值,根據公式計算殺傷率：殺傷率(%)=[1-(實驗組A值 -效應細胞對照A值)/靶細胞對照 A值]×100%。

1.3 統計學分析 應用 SPSS 13.0統計軟件,計量資料以±s表示,采用單因素方差分析和t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SEA的誘導表達 將重組質粒 pET22b-SEA轉入大腸桿菌 BL21(DE3),加入終濃度 1mmol/L ITPG過夜誘導,離心收集菌體,超聲波破碎細胞后分離上清與沉淀,SDS-PAGE電泳分析結果見圖 1。表達產物的蛋白分子量約 30 kDa,與理論值大小一致,而轉入空質粒 pET22b的大腸桿菌總蛋白抽提液中未出現這一條帶。說明重組質粒 pET22b-SEA在大腸桿菌 BL21(DE 3)中成功表達。

圖 1 SEA在大腸桿菌 BL21(DE 3)中的表達

2.2 目的蛋白的純化 將獲得的包涵體經洗滌、變性、復性后,用 His?Bind Bu ffer Kit試劑盒進行純化,所得洗脫液進行SDS-PAGE分析(圖 2)。蛋白電泳結果表明目的蛋白已經得到了較好的純化。

圖 2 SEA的純化

2.3 SEA誘導 PBMC殺傷人肺腺癌細胞A 549的顯微觀察

圖 3 SEA誘導 PBMC殺傷 A549的顯微觀察(×200)

表1 不同濃度SEA誘導不同效靶比人PBMC在不同作用時間殺瘤活性比較%,±s

表1 不同濃度SEA誘導不同效靶比人PBMC在不同作用時間殺瘤活性比較%,±s

SEA(g/m l) 12 h 5∶1 10∶1 20∶1 36 h 5∶1 10∶1 20∶1 60 h 5∶1 10∶1 20∶1對照組 14.2±3.5 17.3±2.5 17.9±4.9 19.0±2.0 19.7±5.4 21.0±2.7 21.0±2.7 26.1±4.5 26.9±2.7 0.01 20.8±1.1 21.1±4.6 23.0±2.8 31.1±3.0 40.0±2.5 46.0±1.6 33.6±3.5 39.3±2.8 43.1±3.4 0.1 21.9±4.7 23.3±2.1 29.7±2.2 39.2±2.7 42.9±3.3 48.9±3.7 37.2±3.2 47.6±5.5 51.9±1.6 1 23.4±2.1 29.3±6.3 32.7±1.4 42.7±1.4 53.6±6.5 56.1±2.5 43.5±1.1 48.3±3.2 53.8±3.4 10 26.9±1.8 29.9±2.1 33.0±3.0 46.3±2.6 54.5±4.6 57.2±2.9 45.0±2.6 53.5±3.7 56.8±2.1

將抽提出的 SEA蛋白原液經濾膜過濾除菌(0.2μm),并用20mmol/L HEPES將其濃度稀釋成 10、1、0.1、0.01 g/m l,設效靶比為 5∶1、10∶1、20∶1和對照共 4組,加 PBMC 100 μm/孔與癌細胞 37℃、5%CO2共育。從圖 3中可以看出,A為未加入SEA和 PBMC的 A549細胞;B為加入 SEA和 PBMC 12 h后的照片,可見 PBMC在 SEA的誘導下聚集在 A 549的周圍,對其進行免疫攻擊;C為加入 SEA和 PBMC 60 h后的情況,PBMC在SEA的誘導下對 A549細胞進行殺傷,圖中黑色團狀物質即為經 SEA誘導后 PBMC殺死的 A 549細胞。

2.4 不同濃度SEA誘導人PBMC不同時間殺瘤活性的結果

總體上隨著 SEA濃度的升高,PBMC對腫瘤細胞的殺傷率也隨著升高,0.01、0.1、1 g/ml組間差異有統計學意義(P＜0.05),而 SEA濃度 10g/ml與 1g/ml組間無統計學意義(P＞0.05),所以在一定范圍內 PBMC的殺瘤活性隨 SEA濃度的升高而增強;在與SEA作用36h后PBMC對腫瘤的殺傷作用明顯高于短作用時間組(12h),殺傷率在12 h和36 h組間差異有統計學意義(P＜0.05);而隨著作用時間延長至 60 h時,殺傷率并未出現顯著升高,與 36 h組間無統計學意義(P＞0.05),說明過長的誘導時間對增強殺瘤活性沒有明顯的作用;隨著效靶比的增加,殺瘤活性也隨之提高(P＜0.05)。見表 1。

3 討論

超抗原是一種強大的免疫激活因子,無須 APC的加工處理,可直接結合 APC的 MHCⅡ類分子和 TCRV鏈,激活大量 T細胞,通過細胞毒作用(SDCC)和細胞因子的直接和間接殺傷作用起到抑瘤作用。超抗原活化的 CD8+T細胞 MHCⅡ類分子與 MHCⅡ類陽性的腫瘤細胞相偶聯,即可對后者發揮強烈的殺傷作用。另一方面,超抗原活化的CD4+T細胞也具有直接殺傷表達 MHCⅡ類分子腫瘤細胞功能,而且可增強腫瘤細胞表達 MHCⅡ抗原分子,增強癌細胞刺激宿主免役系統的能力;同時,這些細胞因子又刺激 T細胞進一步增殖分化,又產生更多的細胞因子與 SDCC作用共同導致腫瘤細胞的溶解。以SE等細菌性超抗原誘導免疫細胞的殺瘤活性,是近年來應用超抗原進行腫瘤生物治療的基本研究思路[8,9]。

本實驗結果可以得出,在總體趨勢上,隨著加入SEA濃度的升高,PBMC的殺傷活性也隨著提高,而濃度高于 1 g/m l時,單純增加濃度不會對提高殺傷效率產生明顯作用。有可能由于高濃度的SEA與PBMC作用,誘導出無能 T細胞的形成,也可能由于PBMC無法與過量的SEA作用,此機制尚不清楚。在作用時間方面,SEA與 PBMC作用初期延長作用時間可以明顯增強殺瘤效果,而當誘導時間延長至 60 h后,殺瘤活性并未繼續增強,所以當作用時間達一定程度時,單純延長反應時間也無法提高殺瘤活性。同時殺傷效果還與效靶比呈正相關。

1 Alexander Rosendah,Karin Kristensson,Johan Hansson,et al.Perforin and IFN-Ale involved in the antitumor effects of antibody-targeted superantigens.JBacteriol,1998,170：34-41.

2 Schwartz RH.Modelsof T cellanergy：is there a commonmolecularmechanism.JExp Med,1996,184：1-8.

3 Riesbeck K,Billstrm A,Tordsson J,et al.Endothelial cells expressing an inflammatory phenotype are lysed by superantigen-targeted cytotoxic T cells.Clin Diagn Lab Immunol,1998,5：675.

4 Baker MD,Acharya KR.Superantigens：structure-function relationships.Int JMed Microbiol,2004,293：529-537.

5 金伯泉主編.細胞與分子免疫學.第 1版.北京：科學出版社,2001.372-374.

6 Ren S,Terman DS,Bohach G,etal.Intrapleuralstaphylococcalsuperantigen induces resolution ofmalignantpleural effusionsand a survivalbenefit in non-small cell lung cancer.Chest,2004,126：1529.

7 Baum D,Yaron R,YeUin MJ.TNF,not CD 154(CD 40L),plays a major role in SEB-dependent,CD 4(+)T cell-induced endothelial cell activation in vitro.Cellular Immunology,1998,190：12-22.

8 Hedlund G,Dohlsten M,Petersson C,et al.Superantigen-based tumor therapy：In vivo activation of cytotoxic T cells.Cancer Immunol Immunother,1993,36：89.

9 王藝丹.超抗原及其在腫瘤治療中的作用研究.臨床免疫學雜志,1998,8：36.