新型特異性磷脂酶 A2抑制劑對急性胰腺炎肺損傷的療效研究

阿布力克木 王衛星 徐勝 張昌威 余佳 陳辰

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)進展快,病程兇險,是臨床上常見的嚴重急腹癥,病死率為 15% ～35%[1]。急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是胰腺炎胰外器官損傷中最常見的表現,發生率高達 60%～70%[2],發病 1周死亡約30%存在ALI和急性呼吸窘迫綜合征。ⅡA型分泌型磷脂酶A2(groupⅡA secreted phospholipase A2,sPLA2-Ⅱ A)通過直接損傷破壞質膜、間接產生炎性介質、趨化激活炎性細胞,引起肺部炎性反應,對肺泡上皮細胞毛細血管內皮和肺表面活性物質都有直接的損傷作用[3]。本實驗使用的 sPLA2-ⅡA由北京大學化學院研制,將其應用于大鼠 SAP模型,探討該新型特異性磷脂酶 A2(PLA2)抑制劑在 SAP相關性肺損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗分組、模型制備以及獲取標本 Wistar大鼠 24只,體重 200～250 g(湖北省疾病預防控制中心提供),隨機分為 3組,每組 8只：假手術組(SO組),SAP模型組(SAP組),抑制劑預處理組(抑制劑組,5mg/kg)。實驗前禁食 12 h,禁水 4 h。以 10%水合氯醛腹腔注射(3ml/kg)麻醉,無菌操作下行上腹正中切口進腹,采用 4.5號頭皮針頭穿過十二指腸對系膜緣經乳頭逆行插入主胰管,5%牛磺膽酸鈉(STC)溶液(1m l/kg)沿胰膽管逆行恒速(0.1ml/m in)注射造模。確認沿胰管周圍組織出現水腫、充血,出血等改變,表明造模成功,后關腹。術后皮下補液(2ml/100 g)。

SAP組：術前 30m in股靜脈注射等體積不含 sPLA2-ⅡA抑制劑的溶劑(10%DMSO),然后制備胰腺炎模型。SO組：術前30min股靜脈注射等體積不含 sPLA2-ⅡA抑制劑的溶劑,膽胰管逆行注射等體積的 0.9%氯化鈉溶液。抑制劑組：術前30min股靜脈分別注射 10%DMSO溶解的 sPLA2-ⅡA抑制劑(5mg/kg),制備 SAP模型,同 SAP組。

1.2 材料與試劑 STC購自Sigma公司,使用前無菌 0.9%氯化鈉溶液配置。新型 sPLA2-ⅡA(pku-mdl-101)由北京大學化學與分子工程學院提供,用 10%DMSO新鮮配置,sPLA2活性測定均采用 sPLA2活性分析試劑盒檢測(cayman公司,美國)。

1.3 檢測指標

1.3.1 生化指標：采用本院檢驗科臨床使用的全自動生化分析儀測定血清淀粉酶。

1.3.2 胰腺組織病理學檢測：大鼠胰腺組織用 10%甲醛固定24 h,石蠟包埋切片,行 HE染色,根據 Sadurska等[4]提出的方法,對胰腺水腫、胰腺腺泡壞死、出血和脂肪壞死、炎性和血管周圍炎性浸潤光鏡下進行組織學評分。

1.3.3 肺組織病理學檢測：大鼠肺組織用 10%甲醛固定 24 h,石蠟包埋切片,行 HE染色,光鏡下按 Osman等[5]的標準進行組織學評分。

1.3.4 肺濕干比：取大鼠右中肺稱量肺濕重,置 60℃烤箱連續烘烤 72h,稱量肺干重,計算肺濕干比值。

1.3.5 血清和肺組織 sPLA2-ⅡA活性檢測：組織勻漿液由100mmol/L Tris HCl緩沖液,pH值 7.0,包含 1mmol/L EDTA、10mmol/L CaCl2及 0.3mmol/L Triton。按照 2ml勻漿液∶1 g組織的比例,使用 IKA自動勻漿機(德國)冰上勻漿,10 000 r/min低溫(4℃)離心 30min,取勻漿液上清。sPLA2活性測定均采用 sPLA2活性分析試劑盒(sPLA2asssay kit)檢測(cayman公司,美國),包括 sPLA2分析緩沖液、DTNB、Diheptanoyl Thio-PC底物。

1.3.6 肺組織 sPLA2ⅡA表達：大鼠肺臟組織 PLA2mRNA表達分析：肺臟組織異硫氰酸胍一步法提取細胞總RNA,逆轉錄反應體系包括細胞總RNA 1μl,5X逆轉錄反應緩沖液 7μl,隨機引物 2μl,M-MLV反轉錄酶(Gibeo)200U,37℃反應 60min,99℃ 5min終止反應。上機 94℃變性 45 s,54℃退火 45 s,72℃延伸 45 s,共 35個循環。經 2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外光下觀察照相。用生物電泳凝膠成像系統測出PLA2mRNA和 β-actin表達強度,并計算樣本擴增產物與β-actin的積分光密度比值。PLA2mRNA引物上游序列 5'-GCTTCTACGGTTGCCATTGT-3';下游序列為：5'-AACTGGGCGTCTTCCCTTT-3'。內參照 βactin(207bp)：上游 5'-CCAACTGGGACGATATGGAG-3';下游'-CAGAGGCATACAGGGACAAC-3';(Invitrogen公司設計并合成)。

1.4 統計學分析 應用 SPSS 13.0統計軟件,計量資料以±s表示,多組間進行單因素方差分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清淀粉酶和胰腺炎病理評分 造模后 12 h,SAP組血清淀粉酶明顯高于 SO組(P＜0.01),抑制劑組血清淀粉酶較SAP組明顯降低(P＜0.01),但仍高于 SO組(P＜0.01)。造模后 12 h,SO組胰腺結構正常,幾乎無水腫、出血及炎性細胞浸潤,SAP組胰腺正常結構被破壞,腺泡水腫、出血、壞死明顯,大量炎性細胞浸潤,病理評分較SO組顯著增高(P＜0.01),抑制劑組胰腺腺泡壞死、出血、炎性細胞浸潤,病理評分與SAP組比較均有所改善(P＜0.01)。見表 1。

2.2 肺組織病理學檢測 大體觀察：SO組大鼠肺組織肉眼觀正常;SAP組造模后 12h胸腔有積液,肺水腫加劇,肺表面呈暗紅色,可見散在小出血點;抑制劑組肺水腫較SAP組減輕。光鏡下觀察：SO組大鼠肺組織鏡下結構基本正常;SAP 12 h組出現肺泡和間質水腫、出血,灶性或片狀肺不張,肺泡間隔增寬,大量炎性細胞浸潤,肺組織結構紊亂等改變;抑制劑組肺臟上述病變程度明顯減輕,表現在肺間質充血、炎細胞浸潤減輕。抑制劑組肺組織病理評分較SAP組減輕(P＜0.01)。見表1。2.3 肺濕干重比 SAP組造模后 12 h肺濕干比為 2.214±0.275,抑制劑組肺濕干比 1.568±0.024較 SAP組明顯降低(P＜0.01)。SAP組肺濕干比與 SO組 1.500±0.07比較差異有統計學意義(P＜0.01)。見表 1。

表 1 3組大鼠血清淀粉酶、胰腺病理評分、肺病理評分及肺濕干比例比較n=8,±s

表 1 3組大鼠血清淀粉酶、胰腺病理評分、肺病理評分及肺濕干比例比較n=8,±s

注：與 SO組比較,＊P＜0.01;與 SAP組比較,#P＜0.01

組別 淀粉酶(U/L) 胰腺病理評分 肺病理評分 肺濕干比SO組 1 270±400 0.3±0.5 0.23±0.42 1.500±0.701 SAP組 7 272±1 842＊ 11.6 ±1.0＊ 2.24 ±0.79＊ 2.214±0.275＊抑制劑組 4 524 ±605＊# 8.4 ±0.8＊# 1.62 ±0.52＊# 1.568±0.024＊#

2.4 血清和肺組織 PLA2活性 造模后 12 h,SAP組、抑制劑組血清和肺組織 PLA2活性較 SO組均明顯升高(P＜0.01),抑制劑組血清和肺組織 PLA2活性與 SAP組比較,差異有統計學意義(P＜0.01)。見表 2。

2.5 肺組織sPLA2-ⅡA mRNA表達分析 SO組大鼠肺組織PLA2mRNA表達微弱,SAP組造模后12h表達水平升高,與 SO組比較差異有統計學意義(P＜0.01);抑制劑組PLA2m RNA表達水平較 SAP組明顯降低(P＜0.01),但表達較SO組仍升高(P＜0.01)。 SO組 sPLA2-Ⅱ A mRNA/β-actin灰度比值與SA組和抑制劑組比較,差異有統計學意義(P＜0.01);SAP組sPLA2-ⅡA mRNA/β-actin灰度比值與抑制劑組比較,差異有統計學意義(P＜0.01)。見表 2、圖 1。

表 2 3組大鼠血清和肺組織 PLA 2活性、肺組織PLA2-ⅡA-mRNA/-acti灰度比值比較n=8,±s

表 2 3組大鼠血清和肺組織 PLA 2活性、肺組織PLA2-ⅡA-mRNA/-acti灰度比值比較n=8,±s

注：與SO組比較,＊P＜0.01;與SAP組比較,#P＜0.01

組別血清 PLA2活性(μmol? min-1? L-1)肺組織 PLA2活性(mol? min-1? L-1)sPLA2-ⅡA mRNA/β-actin灰度比值SO組 475±50 56±9 1.33±0.27 SAP組 707±48＊ 109±13＊ 1.86±0.11＊抑制劑組 581±58＊# 87±9＊# 1.60±0.13＊#

圖 1 肺臟 sPLA2 mRNA表達的結果

3 討論

PLA2是一類存在于細胞膜的磷脂水解酶,廣泛分布于細胞的質膜、細胞器。它分為分泌型 PLA2(sPLA2)、胞漿型 PLA2(cPLA2)及非鈣依賴型 PLA2(iPLA2)。sPLA2包括 PLA2-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅸ和Ⅹ,均為小分子水溶性蛋白質,都具有一個含天門冬氨酸和組氨酸的催化位點,其最大活性依賴結合于酶活性中心的 Ca2+濃度以及合適的 pH值水平。其中,sPLA2-ⅡA富二硫鍵、低分子量(14.4 kDa)、最適 pH值為 7～9,鈣離子依賴型。正常哺乳動物組織細胞中sPLA2-ⅡA低表達。急性胰腺炎時 sPLA2在胰腺、肺等強表達,參與了胰腺局部壞死和系統性炎性的進展[6,7]。

本實驗建立大鼠 SAP模型,觀察肺濕干比例、肺組織病理改變,發現 SAP組大鼠發生了嚴重的肺損害,同時肺組織sPLA2-ⅡA mRNA表達、sPLA2活性增高,這提示了 sPLA2參與了 SAP相關性肺損害過程。有研究表明,sPLA2-ⅡA作用于肺泡表面活性物質,使其分解為對細胞有毒性的溶血卵磷脂,肺泡活性物質的減少導致肺泡表面張力增加,肺順應性降低,最終導致肺損傷[8,9]。此外,sPLA2-ⅡA可以直接分解膜磷脂,破壞膜結構,增加細胞膜的通透性,從而直接損傷肺泡Ⅱ型上皮細胞結構和功能,導致肺組織損傷[9]。通過研究發現,sPLA2-ⅡA可通過NF-kB途徑刺激巨噬細胞內iNOS的表達,產生過氧化亞硝酸鹽而損傷肺組織[10]。

本研究使用的新型PLA2抑制劑由北京大學化學院研制,是一種特異性分泌型 PLA2的抑制劑,對 sPLA2-ⅡA具有較強抑制作用。我們前期研究當中,發現了 5mg/kg劑量是減輕SAP大鼠胰腺病例損傷的較安全,有效劑量。本研究中,SAP組大鼠血清淀粉酶,胰腺病理評分,血清sPLA2活性等指標高于 SO組,表明 sPLA2與胰腺炎嚴重程度密切相關。

在應用該抑制劑的SAP大鼠,不僅上述指標均低于 SAP組,而且肺組織 sPLA2-ⅡA mRNA表達降低、sPLA2活性亦明顯被抑制,并減輕了肺組織的病理損傷評分。因此,應用該新型PLA2抑制劑對SAP相關性肺損傷較好的保護作用。

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3 Qin S,Pande AH,Nemec KN,et al.The N-term inalα-helix of pancreatic phospholipaseA 2 determ ines productive-mode orientation of the enzyme at themembrane surface.JMol Biol,2004,344：71-89.

4 Sadurska B,Szum i M.PhospholipasesA 2 in mammalian cells：structure,properties,physiological and pathological role.Postepy Hig Med Dosw(Online),2005,29：116-123.

5 Osman MO,Kristensen JU,Jacobsen NO,et al.A monoclonal anti-interleukin-8antibody(WS-4)inhibits cytokine response and acute lung injury in experimental severe acute necrotizing pancreatitis in rabbits.Gut,1998,43：232-239.

6 Miura M,Endo S,Kaku LL,et al.Plasma type II phospholipaseA 2 levels in patients with acute pancreatitis.Res Commun Mol Pathol Pharmacol,2001,109：159-164.

7 Abraham E,Naum C,Bandi V,et al.Efficacy and safety of LY 315920Na/S-5920,a selective inhibitor of 14-kDa groupⅡA secretory phospholipaseA 2,in patients with suspected sepsis and organ failure.Crit Care Med,2003,31：718-728.

8 陳熹,姚恒,紀宗正,等.磷脂酶 A 2對急性胰腺炎大鼠肺損傷的作用.第四軍醫大學學報,2003,24：955-959.

9 Schrama AJ,de BeaufortAJ,Sukul YR,et al.PhospholipaseA2 is present In meconium and inhibits the activity of Pulmonary surfactantin vitro study.Acta Paediatr,2001,90：412-416.

10 Tsukahara Y,Morisaki T,Horita Y,et al.PhospholipaseA 2 mediates nitric oxide production by alveolarmacrophagesand acute lung injury in pancreatitis.Ann Surg,1999,229：385-392.